何文君，石張鎮(zhèn)，胡南均，孫延霞

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 血液腫瘤科，吉林 長春130033)

急性髓系白血病(AML)是一種骨髓造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其主要特征是骨髓和外周血中原始和未成熟的骨髓細(xì)胞發(fā)育不良。多數(shù)情況下病情急、重，預(yù)后差，不及時(shí)治療可能危及生命[1]。盡管已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究來識(shí)別和發(fā)現(xiàn)預(yù)后標(biāo)記，但AML的死亡率仍然很高。近幾十年來，大量研究表明許多基因突變和基因異常表達(dá)與AML的預(yù)后密切相關(guān)。已經(jīng)報(bào)道的具有預(yù)后意義的突變基因包括FLT3、KIT、CEBPA、N-RAS、FES、FOS、GATA-1、JUN B、MPL、MYC、p53、PU.1、RB、WT1、RUNX1、WNT、NPM1、CBF、RAR-α、HOX、MLL[2-4]。目前臨床實(shí)踐中廣泛使用NPM1、WT1、CEBPA和FLT3突變來評(píng)估AML危險(xiǎn)分層及指導(dǎo)治療[5]，但是很多病例不存在上述基因突變，所以這些患者很難被準(zhǔn)確評(píng)估其預(yù)后。最近的研究表明，新的AML生物標(biāo)志物的識(shí)別有助于更好地理解疾病的分子基礎(chǔ)，對(duì)AML的篩查、診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)以及評(píng)估個(gè)體治療反應(yīng)都非常有益[4]。因此，迫切需要探索新的準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物來改善AML風(fēng)險(xiǎn)分層，評(píng)估預(yù)后。本研究基于對(duì)AML患者基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，構(gòu)建了AML 1年預(yù)后生存模型。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取與篩選

首先，從GDC(Genomic Data Commons)的外部鏈接Broad Firehose數(shù)據(jù)庫(Firehose數(shù)據(jù)庫中AML項(xiàng)目源于美國麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)研究所共建的Broadinstitute運(yùn)行的GDAC，提供較為完善的以TCGA數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的各類信息檢索)中下載關(guān)于AML患者的臨床及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出符合要求的生存期及mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的病歷共163例，病例截止時(shí)間為2016年1月28日。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異基因篩選

基于R語言對(duì)上述數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理：以生存期1年為界限將163例患者分為≥1年生存期、<1年生存期兩組，根據(jù)表達(dá)量對(duì)基因進(jìn)行過濾，過濾掉低表達(dá)量的基因，本研究自定義該閾值為表達(dá)量為0的值≥10個(gè)的基因，并形成數(shù)據(jù)矩陣。利用R語言的DESeq程序包，以|log2FoldChange|>1.0，調(diào)整后P值<0.05作為篩選條件，鑒別差異表達(dá)基因(DEGs)。

1.3 機(jī)器學(xué)習(xí)建模

篩選|log2FoldChange|≥1.4，校正后P值<0.05的差異表達(dá)基因共20個(gè)(表1)，利用基于R語言的Rattle包，首先將20個(gè)差異表達(dá)基因數(shù)集進(jìn)行背景矯正和歸一化處理，原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過[0,1]轉(zhuǎn)換，將163名患者以7∶3比例分為訓(xùn)練集和內(nèi)部驗(yàn)證集，構(gòu)建決策樹、RF、Boost、SVM、線性邏輯回歸、ANN生存分析模型，利用受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)估模型預(yù)測(cè)預(yù)后能力，并進(jìn)行內(nèi)部數(shù)據(jù)驗(yàn)證，從而篩選出AUC值最高的Boost模型作為最理想的預(yù)后模型。

2 結(jié)果

2.1 差異基因識(shí)別

通過使用R語言DESeq程序包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因識(shí)別，以校正后P值<0.05,|log2FoldChange|≥1.4作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)20個(gè)差異表達(dá)基因。其中，表達(dá)水平上調(diào)的基因5個(gè)(EBF4、MTUS2、NT5E、AEF2、IGDCC4)，表達(dá)水平下調(diào)的基因15個(gè)(ADAMTS2、TRPM4、PACSIN1、CACNG4、SPON1、CCDC3、C10orf72、MAOA、ESPN、CIQA、LILRA4、UBXN10、LIF、WDR86、PEG10)。差異表達(dá)基因的情況見表1。

表1 差異表達(dá)基因

2.2 機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)后模型分析

機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)訓(xùn)練集學(xué)習(xí)其規(guī)律后，對(duì)驗(yàn)證集進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而評(píng)價(jià)決策樹、RF、Boost、SVM、線性回歸、ANN預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。決策樹的AUC值為0.63，RF的AUC值為0.72，Boost的AUC值為0.75，SVM的AUC值為0.72，線性回歸的AUC值為0.71，ANN的AUC值為0.66。經(jīng)ROC曲線評(píng)判，結(jié)果顯示Boost對(duì)AML患者1年生存情況的預(yù)測(cè)效果更佳，詳情見圖1-6，6種預(yù)后模型預(yù)測(cè)能力對(duì)比見表2。

3 討論

AML是一種異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，死亡率高，預(yù)后較差，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)異常在其發(fā)病的不同階段、疾病預(yù)后和臨床特點(diǎn)等方面起著至關(guān)重要的作用。因此，研究AML遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)異常、全面認(rèn)識(shí)發(fā)病機(jī)制、探索新的預(yù)后基因是目前亟待解決的問題。

圖1 決策樹預(yù)測(cè)模型ROC曲線 圖2 RF預(yù)測(cè)模型ROC曲線 圖3 Boost預(yù)測(cè)模型ROC曲線

圖4 SVM預(yù)測(cè)模型ROC曲線 圖5 線性回歸預(yù)測(cè)模型ROC曲線 圖6 ANN預(yù)測(cè)模型ROC曲線

表2 6種預(yù)后模型預(yù)測(cè)能力對(duì)比

一項(xiàng)納入200例確診為AML患者的TCGA-AML子研究通過全基因組(50例)、全外顯子測(cè)序(150例)，以及RNA和miRNA測(cè)序和DNA甲基化分析，發(fā)現(xiàn)幾乎所有樣本在與發(fā)病機(jī)制有關(guān)的九類基因中至少有1個(gè)顯著突變，包括:轉(zhuǎn)錄因子融合、NPM1基因、腫瘤抑制基因、DNA甲基化相關(guān)基因、信號(hào)基因、染色質(zhì)修飾基因、髓樣轉(zhuǎn)錄因子基因、內(nèi)聚蛋白復(fù)合物基因和剪接體復(fù)合物基因，這些基因突變與患者預(yù)后密切相關(guān)[6]。而近年來的研究表明，影響患者預(yù)后的因素除了與患者的一般臨床資料、治療方案、染色體異常、表觀遺傳因子突變、DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、miRNA、蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)外[4]，基因表達(dá)量也可作為AML患者預(yù)后的標(biāo)志。一項(xiàng)210名接受強(qiáng)化化療的細(xì)胞遺傳學(xué)正?；颊叩年?duì)列研究表明，ERG基因高表達(dá)與較低的完全緩解率(CRs)，較短的中位無進(jìn)展生存期(PFS)相關(guān)，高ERG表達(dá)水平是一種負(fù)性預(yù)測(cè)因子[7]。一項(xiàng)回顧性研究表明，骨髓中SET基因表達(dá)水平與AML發(fā)病及其預(yù)后有顯著相關(guān)性，SET基因高表達(dá)組中位總生存期 (OS)、PFS明顯低于低表達(dá)組[8]。最近一項(xiàng)納入111例正常核型AML患者的研究表明，BAALC和(或)MN1基因高表達(dá)組預(yù)后不佳，CRs降低，BAALC和MN1表達(dá)水平可用于更精確的正常核型AML患者的風(fēng)險(xiǎn)分層，特別是 FLT3-ITD-/NPM1-的患者，可將中間風(fēng)險(xiǎn)組轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)后不佳組[9]。

隨著大規(guī)?；蚪M學(xué)測(cè)序的興起，機(jī)器學(xué)習(xí)(ML)算法越來越多地被應(yīng)用到基因表達(dá)分析中，目的是對(duì)腫瘤進(jìn)行分類，預(yù)測(cè)生存，確定治療目標(biāo)，并根據(jù)功能對(duì)基因進(jìn)行分類[10-13]。近年興起的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，如基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的決策樹、RF、SVM、線性回歸、ANN適用于高維數(shù)據(jù)的分析，可以得到具有較好泛化能力的預(yù)測(cè)模型。董華等人使用機(jī)器學(xué)習(xí)中的決策樹算法實(shí)現(xiàn)了對(duì)三陰性乳腺癌的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確率達(dá)95.5%[14]。Luan等人使用支持向量機(jī)對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行智能決策，該實(shí)驗(yàn)表明支持向量機(jī)在該疾病的診斷中效果良好[15]。Boost是一種通過累加弱模型來產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)模型的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，他是通過不斷消除殘差來提高模型精度，著重優(yōu)化了兩個(gè)不同的方面：偏差 (Bias)和方差(Variance)，能夠很靈活地?cái)M合各種復(fù)雜的訓(xùn)練樣本。一項(xiàng)預(yù)測(cè)668例顱內(nèi)腫瘤手術(shù)24小時(shí)內(nèi)發(fā)生早期術(shù)后并發(fā)癥的研究表明，應(yīng)用梯度Boost機(jī)器學(xué)習(xí)算法，可以創(chuàng)建一個(gè)優(yōu)于傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法的預(yù)測(cè)模型[16]。

本課題組前期已經(jīng)完成人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立術(shù)前判斷進(jìn)展期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷模型，其優(yōu)于傳統(tǒng)的Logistic多元回歸分析，有望幫助相關(guān)科室提高判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確率[17]。本研究以AML為研究對(duì)象，利用Firehose數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。通過分析，篩選出20個(gè)基因?yàn)轭A(yù)后相關(guān)基因構(gòu)建AML預(yù)后預(yù)測(cè)模型，Boost模型AUC值0.7534,能較準(zhǔn)確的通過基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)AML預(yù)后，盡管本研究僅基于基因表達(dá)量，通過生物信息學(xué)分析角度研究急性髓系白血病潛在的預(yù)后標(biāo)志物，但仍然為急性髓系白血病的進(jìn)一步危險(xiǎn)分層及預(yù)后評(píng)估提供了新的思路，希望在以后的工作中進(jìn)行多組學(xué)分析建模，更加精準(zhǔn)地判斷和評(píng)估AML預(yù)后。