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      新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)實驗診斷進展

      2021-03-25 02:09:56黃一博劉傳志
      中國實驗診斷學 2021年3期
      關鍵詞:敏感性特異性引物

      黃一博,劉傳志,侯 玥

      (長春理工大學生命科學技術(shù)學院,吉林 長春130022)

      目前,一種新型病毒引起的傳染性肺炎疾病正在全球爆發(fā)。事件中涉及的病毒被確認為第七種冠狀病毒,成為本世紀第三種人畜共患的冠狀病毒,對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。世界衛(wèi)生組織(WHO)將病毒引起的疾病正式命名為冠狀病毒病2019(COVID-19)[1]。截至2020年9月,與COVID-19相關的確診病例接近3300萬,給全球人類健康帶來巨大挑戰(zhàn)和嚴重經(jīng)濟損失[2-6]。

      SARS-CoV-2感染的不確定潛伏期和非特異性癥狀流行情況更加嚴重[7-9]。在缺乏有效的COVID-19抗病毒治療方法和疫苗的情況下,特別需要高通量、操作簡便的快速檢測方法,可在早期靈敏地檢測SARS-CoV-2感染,以應對不斷發(fā)展的冠狀病毒爆發(fā)并預防和控制流行[10]。本文描述了目前SARS-CoV-2感染的實驗診斷進展,希望有助于COVID-19感染快速準確的實驗室診斷和治療。

      1 SARS-CoV-2生物學特性及感染機制

      冠狀病毒(CoVs)是一種具有正單鏈RNA基因組的包膜病毒,是目前發(fā)現(xiàn)的最大的RNA病毒基因組[11-12]。在SARS-CoV-2出現(xiàn)之前,MERS-CoV和SARS-CoV引起了大范圍爆發(fā),感染后會有明顯的癥狀,曾出現(xiàn)過大的爆發(fā)和致死,但與SARS-CoV-2相比,SARS-CoV-2表現(xiàn)出了更強的傳染性,造成了更嚴重的后果[12]。

      SARS-CoV-2是β-冠狀病毒屬亞屬sarbecovirus,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)作為細胞受體是SARS-CoV-2與SARS-CoV同一進入細胞結(jié)合位點,從而感染人類[6]。SARS-CoV-2的直徑介于50至200 nm之間,由29 881 bp的基因組成[13]。SARS-CoV-2基因組至少有四個結(jié)構(gòu)編碼蛋白,分別稱為核衣殼(N),刺突(S),包膜(E)和膜(M)。N蛋白保留病毒基因組,S蛋白、E蛋白和M蛋白構(gòu)成病毒包膜。其中,S蛋白介導病毒進入宿主細胞,并在一定程度上確定病毒感染過程中的宿主范圍[14]。

      SARS-CoV-2與大部分RNA病毒最大的區(qū)別是SARS-CoV-2對宿主細胞的選擇和與宿主細胞膜的融合方式,這兩點歸結(jié)于一種關鍵的蛋白——刺突蛋白。正常情況下,三個刺突蛋白組成一個S蛋白三聚體,這些結(jié)構(gòu)分散著鑲嵌在病毒的表面,形成一個個“冠狀”結(jié)構(gòu),這也是冠狀病毒得名的原因所在。

      刺突蛋白可分為兩個部分:S1和S2。S1位于遠病毒端(蛋白質(zhì)的N端),含有一個關鍵的受體結(jié)合區(qū)(RBD),負責跟宿主細胞表面的特定蛋白質(zhì)(稱為受體)進行特異性結(jié)合與識別[15];S2位于近病毒端(蛋白質(zhì)的C端),含有一個融合肽區(qū)(FP),對病毒包膜與宿主細胞膜融合至關重要。兩者之間還擁有一個酶切位點,稱為分開點。因為S1和S2的功能是依序進行,所以S1執(zhí)行功能后必須在分開點與S2斷開,才可保證S2功能的完成。隨后,作為病毒遺傳物質(zhì)的正鏈RNA釋放到宿主細胞內(nèi),借助宿主的翻譯機制、合成原料等進行病毒繁殖,條件成熟后釋放出大量子代SARS-CoV-2,開啟對宿主細胞的新一輪感染。

      人類感染SARS-CoV-2主要途徑是通過呼吸道飛沫、接觸和糞便傳播。SARS-CoV-2的估計感染率(R0)從2.2到5.7[16-17],而報告的SARS-CoV的R0約為3[18]。據(jù)推測,原發(fā)性病毒復制發(fā)生在上呼吸道的黏膜細胞(咽和鼻腔),并在下呼吸道和胃腸道的黏膜細胞中繁殖[19-20]。Neeltje等揭示在組織培養(yǎng)實驗中SARS-CoV-2氣溶膠仍然具有傳染性,并且在3小時的觀察期內(nèi)感染性僅略有下降[21]。最近的一些研究報道,在糞便樣本中檢測到SARS-CoV-2[22-23]。盡管這些證據(jù)表明SARS-CoV-2也可能是通過糞-口途徑傳播的腸道病毒,但這些發(fā)現(xiàn)是基于極少數(shù)患者的情況,因此有待進一步研究。

      2 SARS-CoV-2的實驗診斷

      2.1 SARS-CoV-2檢測的標本種類

      在實驗診斷過程中,標本的采集是實驗診斷COVID-19的關鍵步驟。目前可采集的標本包括呼吸道標本,血液標本,糞便及尿液標本[2,22-28]。其中,呼吸道分泌物是最簡便和常用的診斷標本。

      ACE2主要分布在II型肺泡上皮細胞中[29],表明下呼吸道標本(包括痰液,氣管吸出物)可能含有較高的病毒RNA量。Yu等比較了127名確診或疑似COVID-19患者的痰液,咽拭子和鼻拭子的平均病毒載量。研究發(fā)現(xiàn),痰中的平均病毒載量(17429±6920拷貝/測試)明顯高于鼻拭子(651±501拷貝/測試)和咽拭子(2552±1965拷貝/測試)[27]。臨床觀察表明,在感染期間,在COVID-19患者的唾液樣本中經(jīng)常檢測到SARS-CoV-2,通過RT-PCR在12名COVID-19患者中的11名唾液樣本中鑒定出SARS-CoV-2。住院后,連續(xù)唾液的病毒載量監(jiān)測總體呈下降趨勢[30-31]。

      除了最常見的呼吸道標本,非呼吸道標本中也經(jīng)常檢測到SARS-CoV-2。據(jù)報道,從1名確診的COVID-19患者的尿液樣本中檢測到SARS-CoV-2[32],通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測到60名COVID-19患者中有2名眼淚和結(jié)膜拭子樣本SARS-CoV-2呈陽性[33]。

      2.2 SARS-CoV-2的核酸檢測

      依據(jù)公開數(shù)據(jù)庫發(fā)布的SARS-CoV-2基因組,對目標基因設計的特異性引物和探針可以實現(xiàn)COVID-19的實驗室診斷。到目前為止,用于檢測SARS-CoV-2的基因靶標包括N,E,S,RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)和開放閱讀框架1ab(ORF1ab)基因測試[34]。

      核酸檢測方法包括RT-PCR、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)等。其中,實時定量RT-PCR(qRT-PCR)作為SARS-CoV-2鑒定的金標準,也是世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的常規(guī)確認試驗[35-36]。但對實驗場所及人員要求高、耗時長,檢測人員感染風險高,檢測結(jié)果受樣本質(zhì)量、實驗條件及人員操作等因素影響較大,特別是假陰性問題,使核酸檢測的作用一度被質(zhì)疑[34]。SARS-CoV-2實驗室診斷方法的優(yōu)缺點,見表1。

      表1 SARS-CoV-2實驗室診斷方法的優(yōu)缺點[37]

      2.2.1實時定量RT-PCR 世衛(wèi)組織網(wǎng)站提供了幾種qRT-PCR方案,用于檢測不同國家的SARS-CoV-2[34]。不同機構(gòu)中SARS-CoV-2的RT-PCR測試/引物顯示見表2。美國疾病預防控制中心(CDC)成立了一個RT-PCR小組,專門檢測SARS-CoV-2和通用檢測SARS樣β-CoV。為N基因設計了三套不同的引物,一套引物/探針普遍用于檢測所有β-CoV,而另兩套則特異性地鑒定SARS-CoV-2。對于所有三個目標,COVID-19的確認都必須為陽性[38]。德國Charite開展了兩種用于檢測SARS-CoV-2,SARS-CoV和蝙蝠樣β-CoV的RdRP和E基因的核酸測試。兩項檢測均為陽性可進入檢測的下一步,即針對RdRP基因的SARS-CoV-2特異性RT-PCR檢測[39]。

      雖然各相關機構(gòu)對SARS-CoV-2測試制定了不同的方案,但基于不同目標的核酸測試結(jié)果是否具有可比性仍然不明確。Chantal等使用了從COVID-19患者中分離的RNA轉(zhuǎn)錄本來比較分別在美國,德國,香港和中國建立的四種qRT-PCR分析的靈敏度[40]。研究發(fā)現(xiàn),在qRT-PCR測試中使用的所有引物探針組中都可以檢測到SARS-CoV-2,但在檢測限和識別病毒載量較低的陰性和陽性的能力方面發(fā)現(xiàn)了顯著差異。在E-Sarbeco(德國),2019-nCoV_N1(美國)和HKU-ORF1(香港)中發(fā)現(xiàn)了靈敏度最高的引物探針組,而在RdRP-SARSr(德國)中發(fā)現(xiàn)了最低的靈敏度,這可能與反向引物的錯配有關[40]。此外,Konrad等在德國使用COVID-19患者的鼻咽拭子或痰液樣本比較了不同PCR系統(tǒng)和商業(yè)試劑中的qRT-PCR測試[41]。當使用相同的引物和探針時,還觀察到了不同PCR系統(tǒng)之間分析靈敏度的差異。他們發(fā)現(xiàn),使用單步qRT-PCR系統(tǒng)時,E基因靶標比RdRP靶標更敏感。然而,E基因靶標的高背景妨礙了對測試的清晰評估,并且進一步優(yōu)化E基因測定法可以提高靈敏度。

      表2 不同機構(gòu)中SARS-CoV-2的RT-PCR測試/引物[37]

      2.2.2巢式RT-PCR 巢式RT-PCR分析法已被證明適用于檢測疾病早期的低拷貝數(shù)SARS冠狀病毒[42]。在疫情爆發(fā)的早期,日本已驗證了通過巢式RT-PCR 檢測SARS-CoV-2的方法[43]。最近,日本設計了一種用于靶向SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的一步式巢式RT-PCR(OSN-qRT-PCR)分析。該測定法的靈敏度為1個拷貝/測試,比商業(yè)qRT-PCR測定法(10個拷貝/測試)高10倍。在181份臨床樣本中,通過OSN-qRT-PCR確認了14份qRT-PCR陰性的樣本。另外,通過OSN-qRT-PCR證實7例在灰色區(qū)域中qRT-PCR陽性的樣品為陽性[44]。與qRT-PCR試劑盒相比,巢式RT-PCR分析顯示出更高的靈敏度和特異性。但是,巢式RT-PCR可能導致實驗室交叉污染,假陽性結(jié)果增多。

      2.2.3液滴數(shù)字PCR(ddPCR) 液滴數(shù)字PCR被證明檢測SARS-CoV-2時具有較高的靈敏度和準確性[45]。Suo等使用中國疾病預防控制中心針對ORF1ab或N基因發(fā)布的相同引物/探針組,分析了ddPCR與qRT-PCR相比用于SARS-CoV-2 RNA檢測的可行性。ddPCR證實26例RT-PCR陰性的COVID-19患者為陽性。靈敏度和準確性從RT-PCR的40%和47%分別提高到ddPCR的94%和95%。出院后5-12天內(nèi),ddPCR顯示有6/14例患者(42.9%)呈陽性[45]。研究表明,ddPCR可以大大減少qRT-PCR引起的假陰性結(jié)果。該團隊使用相同樣品和條件的8個引物/探針組進一步嚴格分析了ddPCR和qRT-PCR的性能。結(jié)果顯示,qRT-PCR中使用的所有8種引物/探針均無法在低病毒載量(10-4稀釋度)下明顯區(qū)分陽性和陰性。發(fā)現(xiàn)美國CDC-N1,N2和中國CDC-N引物/探針集的qRT-PCR測試的假陽性結(jié)果。相反,ddPCR的整體性能明顯優(yōu)于qRT-PCR,特別是對于低病毒載量的樣品[46]。

      2.2.4環(huán)介導的等溫擴增 LAMP技術(shù)具有在固定溫度下快速擴增的優(yōu)勢,在快速診斷冠狀病毒中具有重要意義。Zhang等設計了針對SARS-CoV-2的ORF1a和N基因5'區(qū)域的完整LAMP引物,通過與RT-PCR方法進行視覺比色分析。7個樣品中有6個顯示出可見的顏色變化,表明擴增為陽性,而1個樣品則保持粉紅色并確認為陰性。比色分析的RT-LAMP在一定范圍的Cq值上與RT-PCR結(jié)果100%一致,并且無需使用復雜的儀器即可在現(xiàn)場檢測,并與現(xiàn)場設置RT-PCR檢測結(jié)果相同[47]。

      2.3 SARS-CoV-2的抗原檢測

      SARS-CoV-2是由多種病毒編碼蛋白質(zhì)組成的,包括S,N,E和M蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)中,S和N是SARS-CoV-2抗體的兩個主要抗原靶標[48]。S蛋白可分為兩個獨立的多肽,即S1和S2[49]。雖然S蛋白對于病毒進入細胞至關重要,存在于病毒表面,但N蛋白是與RNA相互作用且表達最豐富的蛋白,比S蛋白更保守[49]。在S蛋白中,S1的保守性較低,對SARS-CoV-2的特異性更高,表明S1的特異性比全長S或S2的抗原更重要,是COVID-19血清學檢測的靶標[49]。此外,S1蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域比S1或全長S更保守,并且與其他冠狀病毒的交叉反應性要低[50]。

      免疫層析法是檢測SARS-CoV-2抗原最常用的方法[51]。Lorena等比較了四種免疫層析法抗原檢測試劑盒(RapiGEN,Liming bio,Savant和Bioeasy)檢測SARS-CoV-2的情況,并顯示出顯著差異的測試性能。在這些測試中,Bioeasy測試顯示出最高的準確度,為89.2%,而Liming生物測試由于性能不佳而在測試過程中被中止。其他試劑盒的敏感性范圍從Savant分析的16.7%到Bioeasy測試的85%[51]。

      與免疫色譜法靈敏度相比,目前研究出基于高靈敏度SARS-CoV-2生物傳感器已在檢測中進行了應用測試。Sophie等開發(fā)了一種便攜式的基于細胞的快速生物傳感器,帶有S1抗體,可用于檢測SARS-CoV-2 S1蛋白[52]。生物傳感器可以在3分鐘內(nèi)完成檢測,檢測限為1 fg/mL,線性響應范圍為10 fg至1 μg/mL。

      2.4 SARS-CoV-2的抗體檢測

      雖然核酸檢測是確診病毒感染的“金標準”,但由于標本采集部位、時間、試劑質(zhì)量、實驗室質(zhì)量管理體系等因素的影響,核酸檢測的誤差無法完全避免??贵w檢測可以作為對核酸檢測的有效補充[53]。當病毒感染人體后,因抗原刺激作用,人體會產(chǎn)生特異性抗體,可通過檢測人體內(nèi)特異性抗體的存在來間接判斷是否感染病毒。我國《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》明確將抗體檢測結(jié)果納入確診病例的診斷標準,以及疑似病例的排除標準[54]。

      抗體檢測的樣本主要是血清、血漿或全血,檢測技術(shù)主要分為3類:化學發(fā)光法、膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附試驗。

      2.4.1酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 酶聯(lián)免疫吸附測定是最常用的一種免疫分析方法。Kohmer等比較了Vircell COVID-19 IgG(重組N蛋白)和Euroimmun SARS-CoV-2 IgG(重組S蛋白)在SARS-CoV-2感染不同階段的檢測性能。PCR確認的COVID-19后第5-9天,Vircell ELISA的敏感性為70.6%,Euroimmun ELISA的敏感性為58.8%。在確認后的10-18天內(nèi),Vircell ELISA的敏感性為100%,Euroimmun ELISA的敏感性為93.8%[55]。同樣,Liu等評估了兩種基于SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的ELISA試劑盒,用于檢測IgG和IgM抗體。該團隊在疾病發(fā)作后6-10天使用基于S蛋白的ELISA測試在不到60%的樣本中檢測到SARS-CoV-2 IgG抗體,并且在發(fā)病后16到20天后樣本的敏感性提高到> 90%[56]。此外,S蛋白的IgG和IgM ELISA的敏感性分別為74.3%和77.1%,N蛋白的IgG和IgM ELISA的敏感性分別為70.1%和68.2%。S蛋白和N蛋白的ELISA測試的總體靈敏度分別為82.2%和80.4%。與N蛋白的ELISA相比,S蛋白的ELISA具有更高的敏感性[56]。

      2.4.2化學發(fā)光免疫測定(CLIA) 化學發(fā)光免疫測定技術(shù)是采用發(fā)光物質(zhì)作為示蹤標記物的原理檢測抗原(或抗體)的分析方法。CLIA的優(yōu)勢最近在SARS-CoV-2的檢測中得到了證明[57]。自COVID-19疫情出現(xiàn)以來,已有SARS-CoV-2血清IgM和IgG抗體CLIA檢測試劑盒在臨床上應用報道[58]。胡紀文等采用37例臨床確診新型冠狀病毒肺炎患者恢復期血清樣本100例對照患者血清樣本,對不同廠家的SARS-CoV-2血清IgM和IgG抗體CLIA檢測試劑盒進行了評估,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于IgM抗體檢測,試劑A和試劑B具有非常好的檢測性能,尤其是試劑B性能最優(yōu),臨床敏感度為56.76%,臨床特異度為99%;對于IgG抗體檢測,三種試劑均具有非常好的檢測性能,三種試劑的臨床特異度均為97.00%,而試劑C的臨床敏感度最高,為97.29%。證明CLIA試劑盒檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體均具有一定的臨床敏感度和特異度[59]。

      2.4.3免疫層析測定 免疫層析測定法具有檢測樣本采集易標準化(全血樣本)、操作簡單、報告時間快(約15 min)的特點,適用于快速篩查,特異性較高,無需特殊設備(目視判定結(jié)果),有助于SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的定性或半定量檢測[60]。

      Isabel等評估了128名COVID-19患者的抗體使用三種用于檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM的免疫層析試劑(Avioq,QuickZen和LaboOn Time)和兩種定量自動免疫檢測(Euroimmun IgG/IgA ELISA檢測和MaglumiTMIgG/IgM CLIA檢測)。該測試在陰性對照樣品分析中的特異性為100%。三種免疫層析測試的總體靈敏度約為70%,未觀察到顯著差異。在癥狀發(fā)作后的第二周內(nèi),所有測試的敏感性都提高了,并且在14天后所有測試的敏感性都達到了相似的水平(91%至94%)[61]。

      張穩(wěn)健等報告了SARS-CoV-2病毒IgM/IgG抗體膠體金免疫層析法檢測效果及臨床應用價值。其中新冠肺炎患者114例,SARS-CoV-2核酸檢測陰性的正常人138例及其他發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例64例,并對診斷病例的病毒核酸、IgM/IgG抗體的時間分布進行了分析。結(jié)果SARS-CoV-2核酸檢測陽性病例為105例,膠體金法檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的敏感性分別為76.2%和86.6%,抗體陽性總體符合率為96.1%;核酸、抗體均為陰性者為73例,總體符合率為100%。健康人和其他發(fā)熱病人中,IgM和IgG檢測特異性分別為99%和98%。研究顯示,膠體金免疫層析法檢測SARS-CoV-2抗體有較好的敏感性及特異性,在新冠肺炎疫情防控中具有一定的應用價值[62]。

      Nicol Thomas等對293例新冠肺炎患者進行CLIA、ELISA和LFIA分析發(fā)現(xiàn):CLIA、ELISA和LFIA對IgG的總體敏感性相當(約80%),在所有檢測患者癥狀出現(xiàn)后14 d以上,檢測免疫球蛋白的敏感度為100.0%。與ELISA (95.8%)相比,CLIA和LFIA對IgG的總體特異性更高(>98%)。ELISA檢測IgA和LFIA檢測IgM的特異性分別為78.9%和95.8%[63]。

      上述三種SARS-CoV-2血清學檢測方法各有優(yōu)劣,酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測成本低,無需測量儀可采用酶標儀定量分析,但缺點是操作步驟繁復,檢測范圍受底物反應影響大;膠體金免疫技術(shù)檢測成本低,無需測量儀器,技術(shù)操作簡單,可以快速出檢測結(jié)果,不足之處在于不可定量分析,標記蛋白質(zhì)團聚易造成假陽性;化學發(fā)光免疫技術(shù)靈敏度較高,檢測范圍寬,可定量分析,可實現(xiàn)大量快速檢測,但需要分析儀進行檢測,檢測成本相對較高[64]。

      3 總結(jié)與展望

      目前,COVID-19在全球的流行愈演愈烈,嚴重威脅人類健康??焖俸驮缙诘膶嶒炇以\斷對于診斷感染和控制傳播至關重要。RT-PCR作為SARS-CoV-2鑒定的金標準測試,得到WHO的確認。RT-PCR設計雖然選擇病毒基因組的保守區(qū)域,但由于RNA病毒大量的遺傳變異,引物、探針和靶序列之間的錯配可導致檢測性能降低和假陰性結(jié)果。檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體,作為分子診斷方法的補充,抗體檢測可以幫助調(diào)查正在爆發(fā)的疫情以及對發(fā)作率或爆發(fā)程度進行回顧性評估。然而,由于耗時、昂貴的設備和生物安全要求,針對分子和免疫學測定均不適用于即時診斷。即時檢驗不僅適用于臨床實驗室,而且還可以由受過訓練的非實驗室人員在患者現(xiàn)場(例如醫(yī)師辦公室或急診室)進行檢測,從而使SARS-CoV-2的診斷測試更接近于實驗室。免疫層析測定法是即時檢測的血清學檢測方法,但是商品試劑的性能仍有待提高??傊鍖W檢測可以作為病毒傳播的指標,而RT-PCR檢測可以顯示當前感染該疾病的患者,因此,需要結(jié)合分子和血清學檢測來提高COVID-19的診斷準確性。

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