周曉紅，盧曉麗，楊 雪，連 蕾，馮志星

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院 腺體外科，河北 邯鄲056001)

喉癌是一種臨床上常見的頭頸部癌癥，其早期癥狀不明顯或無(wú)特異性，多數(shù)患者被確診時(shí)已處于中晚期階段，且近年來(lái)隨著環(huán)境污染及人們生活飲食的改變，其發(fā)病逐年上升[1]。目前，手術(shù)結(jié)合放化療等綜合治療是喉癌主要的治療方法，但中晚期患者病情嚴(yán)重，其療效一般且預(yù)后往往較差，故如何提高患者的療效具有重要的臨床意義[2]。而熊果酸是是一種五環(huán)三萜類化合物，對(duì)多種腫瘤均有抑制作用，有助于促使癌細(xì)胞凋亡[3]。此外，相關(guān)研究顯示，B淋巴細(xì)胞瘤-2(bcl-2)、凋亡相關(guān)因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)是細(xì)胞凋亡重要的開關(guān)分子，其在癌細(xì)胞凋亡中具有重要的作用[4-5]。對(duì)此，本研究通過在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中應(yīng)用熊果酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞bcl-2、Bax基因表達(dá)及凋亡的影響，以明確其對(duì)喉癌的抗腫瘤作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 主要材料Hep-2喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(南京凱基生物有限公司)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(中國(guó)上海GIBICO公司)，二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、熊果酸(美國(guó)Sigma公司)，注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)，bcl-2、Bax基因引物(上海博亞生物公司)，caspase-3蛋白抗體(美國(guó)Proteintech公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取分離試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)熒光定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海吉瑪公司，PBS磷酸鹽緩沖液(北京Solarbio公司)，顯色試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，其余材料均購(gòu)自中國(guó)上海Hyclone公司；超凈工作臺(tái)、Facscalibur流式細(xì)胞儀及其配套試劑(美國(guó)BD公司)，核酸蛋白測(cè)定儀和化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)GE公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)儀(美國(guó)Invitrogen公司)，680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，倒置顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，其余儀器均購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞選取 將復(fù)蘇后的Hep-2喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株置入質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好和密度為85%以上時(shí)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，加1 ml胰酶消化、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組及培養(yǎng) 取Hep-2喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為A組、B組、C組，每組10個(gè)復(fù)孔，A組給予常規(guī)培養(yǎng)，B組在此基礎(chǔ)給予50.0 μmol/L熊果酸培養(yǎng)，C組給予6 μmol/L順鉑培養(yǎng)；調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)細(xì)胞/ml，并制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔滴加20 μl的MTT，培養(yǎng)4h后去上清，每孔加入200 μl的DMSO并振蕩10 min，待檢測(cè)。

1.2.3RT-PCR檢測(cè) 于處理1 h和處理1、3、5 d取Hep-2喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、加0.25%胰酶消化并離心(1 000 r/min、5 min)后，收集細(xì)胞、提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)bcl-2、Bax基因引物序列(見表1)，將1 μl的cDNA置于10 μl反應(yīng)體系中94℃擴(kuò)增2 min、膠回收法純化DNA片段后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，以2-△△CT法計(jì)算bcl-2、Bax基因相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算其比值bcl-2/Bax[4-5]。

1.2.4Western Blot(WB)檢測(cè) 于處理1 h和處理1、3、5 d取Hep-2喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白、變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后，設(shè)β-actin對(duì)照組，加1∶1000的caspase-3蛋白一抗，4℃雜交12 h、加二抗、洗膜、顯影后，酶標(biāo)儀掃描分析吸光度后分析灰度值，并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量=(caspase-3蛋白灰度值/β-actin灰度值)×100%。

1.2.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)檢測(cè) 于處理1 h和處理1、3、5 d在96孔板中，每孔加入10 μl的MTT(5 g/L)孵育4 h、加150 μl的DMSO、震蕩10 min，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)吸光度(OD值)，測(cè)量3次并取平均值。

表1 bcl-2、Bax基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組bcl-2、Bax基因表達(dá)量及bcl-2/Bax比較

A組、B組和C組處理1h bcl-2、Bax基因表達(dá)量及bcl-2/Bax比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達(dá)量明顯低于A組，B組和C組處理1、3、5 d的Bax基因表達(dá)量、bcl-2/Bax明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達(dá)量、Bax基因表達(dá)量、bcl-2/Bax比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、3、4和圖1、2。

表2 兩組bcl-2基因表達(dá)量比較(%)

表3 兩組Bax基因表達(dá)量比較(%)

表4 兩組bcl-2/Bax比較

圖1 兩組bcl-2基因表達(dá)量的RT-PCR檢測(cè)

圖2 兩組Bax基因表達(dá)量的RT-PCR檢測(cè)

2.2 兩組caspase-3蛋白表達(dá)量比較

A組、B組和C組處理1h caspase-3蛋白表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的caspase-3蛋白表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5和圖3。

2.3 兩組喉癌Hep-2細(xì)胞A570值比較

A組、B組和C組處理1 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，B組和C組處理1、3、5d的喉癌Hep-2細(xì)胞A570值明顯低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的喉癌Hep-2細(xì)胞A570值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

3 討論

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要與環(huán)境、飲食及生活習(xí)慣、遺傳等有關(guān)，可導(dǎo)致痰中帶血、吞咽困難、聲嘶等癥狀，若未及時(shí)治療，其臨床預(yù)后差、死亡率高[1-2]。而喉癌主要采取以手術(shù)為主、以放療等其他治療為輔的綜合治療，可改善患者的病情，但仍有部分患者因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致療效欠佳，嚴(yán)重影響患者的生存預(yù)后[5-6]。

表5 兩組caspase-3蛋白表達(dá)量比較(%)

圖3 兩組caspase-3蛋白表達(dá)量的WB檢測(cè)

表6 兩組喉癌Hep-2細(xì)胞A570值比較(%)

熊果酸是一種具有多種生物學(xué)活性的五環(huán)三萜類化合物，且隨著研究的深入，其具有良好的抗氧化、抗炎、降血脂、抗增殖、抗癌、抗誘變等作用，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有良好抑制的作用[7-8]。有研究顯示，對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113給予熊果酸處理，其可通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而有效抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[9]。而相關(guān)研究表明，細(xì)胞凋亡是一種繼發(fā)性程序化死亡過程，有多種基因參與調(diào)控，其中bcl-2、Bax是啟動(dòng)凋亡的重要開關(guān)基因，bcl-2具有抑制線粒體破裂、多種凋亡蛋白激活及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度等作用，并可抑制促凋亡蛋白Bax細(xì)胞毒性而抑制細(xì)胞凋亡[10-11]；Bax是受bcl-2調(diào)節(jié)的促凋亡蛋白，具有誘導(dǎo)線粒體滲透性改變、激活凋亡蛋白、釋放細(xì)胞色素等，在細(xì)胞凋亡中具有重要的作用[12-13]。此外，caspase-3是細(xì)胞凋亡中主要的效應(yīng)蛋白，具有破壞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白、裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子、抑制凋亡蛋白活性等作用，其活化可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程并進(jìn)入不可逆階段[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達(dá)量明顯低于A組，B組和C組處理1、3、5 d的Bax基因表達(dá)量、bcl-2/Bax、caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于A組，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達(dá)量、Bax基因表達(dá)量、bcl-2/Bax、caspase-3蛋白表達(dá)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明熊果酸能夠有效下調(diào)喉癌Hep-2細(xì)胞的bcl-2基因表達(dá)及上調(diào)其Bax基因、caspase-3蛋白表達(dá)。這可能是由于熊果酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有良好抑制的作用，能夠有效調(diào)節(jié)多種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，尤其是其可能通過下調(diào)bcl-2基因表達(dá)及上調(diào)Bax基因、caspase-3蛋白表達(dá)等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，使bcl-2基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞抑制線粒體破裂、多種凋亡蛋白激活及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度等作用下降，有助于降低bcl-2基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞凋亡的作用；同時(shí)，上調(diào)Bax基因表達(dá)能夠增強(qiáng)其誘導(dǎo)線粒體滲透性改變、激活凋亡蛋白、釋放細(xì)胞色素等作用，上調(diào)caspase-3蛋白能夠破壞喉癌Hep-2細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、骨架蛋白及裂解其DNA修復(fù)相關(guān)分子，有助于促使喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡。此外，本研究中，B組和C組處理1、3、5 d的喉癌Hep-2細(xì)胞A570值明顯低于A組，此結(jié)果與Niu JT、馬海濱等[13-14]研究相似，B組和C組處理1、3、5 d的喉癌Hep-2細(xì)胞A570值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明熊果酸能夠有效抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖而促使其凋亡。這可能是由于熊果酸能夠有效促使多種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力，尤其是能夠有效調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中bcl-2、Bax基因的表達(dá)平衡狀態(tài)，使喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡信號(hào)增強(qiáng)而促使caspase-3等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加，從而啟動(dòng)喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡進(jìn)程并進(jìn)入不可逆階段而促使喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡。本研究也有不足之處，如熊果酸如何下調(diào)bcl-2基因表達(dá)及上調(diào)Bax基因、caspase-3蛋白表達(dá)仍不清楚，提示仍需大量的研究。

綜上所述，熊果酸可有效抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖能力而促使其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)bcl-2基因表達(dá)及上調(diào)Bax基因、caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)，提示其可望成為喉癌臨床治療的新藥物。