骨髓間充質(zhì)干細胞在體分子影像示蹤技術的研究進展

李天然（綜述） 盧光明（審校）

（1.解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心放射診斷科，北京 100048；2.解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射診斷科，江蘇 南京 21000）

基于自體骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的生物治療是多種疾病最有潛力的治療方法[1-2]。BMSCs移植后，在體BMSCs轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測，即移植后BMSCs的分布、活性、分化、凋亡情況的監(jiān)測，一直是干細胞研究的重要方向[3-4]。采用組織病理學觀察的方法進行移植BMSCs監(jiān)測需要離體進行，屬于有創(chuàng)檢測技術[5]。利用現(xiàn)代多模態(tài)分子影像學技術可實現(xiàn)對BMSCs在體、實時命運轉(zhuǎn)歸的示蹤監(jiān)測，能夠無創(chuàng)顯示BMSCs可能的演進方向[6-7]。移植BMSCs的在體影像監(jiān)測包括兩個方面：一是BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤；二是在體BMSCs分化的示蹤?，F(xiàn)將有關BMSCs分子影像學示蹤技術的研究進展綜述如下。

1 移植 BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤技術

對于移植BMSCs在體遷移、分布、定位的監(jiān)測，從實現(xiàn)技術上分為光學成像、核磁共振成像（MRI）、正電子成像（PET）和單光子成像（SPECT）；從實現(xiàn)方式上主要分為對BMSCs進行直接標記和間接標記兩種方法。

1.1 直接標記法 一種方法是利用超順磁性氧化鐵納米顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）對BMSCs進行標記，通過MRI移植觀察干細胞在腫瘤組織中的定位、遷移及分布。SPIO標記BMSCs主要有兩種方法：一是將SPIO吸附于BMSCs表面，但網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)會清除SPIO標記的細胞；二是細胞將SPIO通過直接吞飲作用、受體介導胞吞作用、轉(zhuǎn)染介導實現(xiàn)示蹤劑內(nèi)在化[8-9]。商品名為菲立磁的SPIO是被美國FDA批準上市的用于臨床MRI成像的示蹤劑。SPIO標記屬于外源性鐵直接標記MRI成像。有學者利用SPIO標記干細胞在體治療軟骨缺損病，在不同時間點行3.0 T MRI掃描，計算T2值作為定量指標，同時利用影像評分法觀察軟骨組織修復情況，結(jié)果顯示，SPIO標記技術有助于利用MRI早期判斷干細胞治療大型動物模型軟骨缺損是否成功[10]。SPIO具有粒徑小、穿透力強、磁標時間長的特點，移植后至少在18周內(nèi)可檢測到磁標細胞，且弛豫率約為同樣條件下釓離子（Gd3+）的7～10倍, 在很低濃度(nmol級)即可在MRI上形成對比，最主要的是，經(jīng)SPIO標記后的BMSCs不改變特性，SPIO對BMSCs無毒性作用、可降解，并且改變粒徑可以改變磁性[11]。甚至有研究表明，SPIO標記對干細胞的生長及其組織修復功能都有增強作用，低強度靜磁場可以增強SPIO協(xié)助促進的成骨分化效應[12]。SPIO主要縮短T2時間，T2信號減低，與周圍組織形成良好對比，即使低濃度也能成像[13]。SPIO磁標細胞的缺點有：①顆粒會導致信號丟失而產(chǎn)生“黑洞”；②鐵因干細胞的增生分裂而被稀釋，使得磁標記的強度下降，因而MRI測定的敏感性降低；③標記細胞死亡后可釋放含鐵標記物，可能會將周圍未標記的細胞標記從而產(chǎn)生假陽性[14-15]。

直接標記移植BMSCs的另一個方法是熒光成像技術。熒光成像技術中碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）技術在生物成像領域的應用已得到拓展。CQDs表面有豐富的羧基基團，通過偶聯(lián)作用可以實現(xiàn)與SPIO結(jié)合，通過吞飲作用進入BMSCs內(nèi)，實現(xiàn)穩(wěn)定標記，且不改變BMSCs的理化性質(zhì)，并具有通過不同波長的熒光激發(fā)實現(xiàn)多顏色熒光成像的優(yōu)勢[16-17]。

1.2 間接標記法 間接標記法主要利用BMSCs是基因良好載體這一特性，有學者指出，BMSCs是基因治療中理想的載體細胞，在BMSCs移植前，將多種外源性目的基因整合至BMSCs基因組中，BMSCs不僅能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達外源性基因，而且能夠定向分化，修補受損的組織[18]。對BMSCs進行基因修飾，使之攜帶分子影像探針基因，可以實現(xiàn)對其示蹤。有學者對BMSCs進行跨膜蛋白-鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)染，使之高表達鐵轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白具有聚集鐵離子的能力，從而產(chǎn)生內(nèi)源性鐵-MRI信號成像，實現(xiàn)對BMSCs的示蹤，其優(yōu)點在于使用內(nèi)源性鐵離子成像，無需外源性探針標記，且內(nèi)源性鐵離子表達穩(wěn)定；缺點是伴隨鐵離子集聚會增加活性氧含量，破壞細胞結(jié)構(gòu)，這成為阻礙在臨床上開展成像示蹤的原因，并且，隨著細胞的分裂，信號會丟失[19-20]。雖然如此，間接標記法仍優(yōu)于直接標記，因其更能體現(xiàn)BMSCs的活力狀態(tài)以及提供更多的細胞功能信息。另有作者將鐵蛋白重鏈（FTH）和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）兩個報告基因同時轉(zhuǎn)染BMSCs對BMSCs進行示蹤，進行體外小動物MRI成像，結(jié)果顯示報告基因能夠為MRI成像提供足夠的信號強度，能夠在體內(nèi)對BMSCs的遷移和分布進行MRI示蹤，并且研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)報告基因轉(zhuǎn)染的BMSCs不影響B(tài)MSCs的生物學特性[21]，這為開展基于內(nèi)源性鐵MRI成像示蹤開辟了新途徑。還有研究者將跨膜蛋白碘化鈉轉(zhuǎn)運體（NIS）的基因?qū)隑MSCs內(nèi)并行正電子核素124I標記，將BMSCs細胞移植至肝癌組織中，可以通過124I-PET 監(jiān)測BMSCs在肝癌組織中的活動情況，且NIS不改變BMSCs的理化性質(zhì)，其另一優(yōu)點是124I半衰期（半衰期4.2 d）較長，適合較長時間反復觀察[22-23]。

直接標記和間接標記示蹤移植干細胞都有缺點，因此，基于BMSCs是基因良好載體這一特性，構(gòu)建穩(wěn)定表達、不改變BMSCs生物學特性、易于標記的多模態(tài)分子影像探針，結(jié)合直接標記和間接標記的優(yōu)點，解決BMSCs轉(zhuǎn)歸的在體、實時分子影像監(jiān)測問題是現(xiàn)代干細胞治療的課題之一。多模態(tài)分子影像探針解決了多分子探針重復成像的弊端，還可通過基因轉(zhuǎn)染實現(xiàn)穩(wěn)定表達和標記，適合長期反復使用。

2 移植BMSCs在體分化的示蹤技術

通過以上所述的示蹤技術，能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)外BMSCs的遷移、分布、定位的多模態(tài)分子影像學監(jiān)測。然而，在動物模型上的活體BMSCs分化示蹤由于受到某些因素如成像所需分化細胞數(shù)量級別、差異性分子影像探針構(gòu)建和成像設備分辨率等的限制而進展緩慢，而對BMSCs在體分化進行示蹤監(jiān)測更有價值和研究意義，可以實現(xiàn)追蹤BMSCs在特定微環(huán)境下定向誘導分化的去向。因此，BMSCs分化轉(zhuǎn)歸的在體示蹤技術受到關注。BMSCs分化示蹤可以分為細胞學水平示蹤和動物模型水平示蹤兩個層次。要完成BMSCs分化轉(zhuǎn)歸的示蹤，必須借助分子生物學研究的最新技術。

2.1 報告基因BMSCs成像 典型的報告基因成像技術是熒光蛋白成像，熒光蛋白成像目前多限于基礎生物學研究。熒光蛋白基因通過病毒和質(zhì)粒等載體與目的蛋白基因整合后，可以在宿主細胞內(nèi)表達并在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光。在體小動物報告基因成像原理是，BMSCs在特定微環(huán)境誘導下的定向分化過程中，會有某些特異性生物活性因子的表達，利用其中某種特異性生物活性因子基因作為目的基因，利用該目的基因表達的特異性活性蛋白（或因子）作為啟動子驅(qū)動MRI報告基因表達，可實現(xiàn)通過MRI報告基因成像監(jiān)測BMSCs的定向分化；反之，當組織中出現(xiàn)某些特異性生物活性因子表達升高時可以說明BMSCs的分化狀態(tài)及其特定分化方向，因此將某種特異性生物活性因子基因作為啟動子基因就可以實現(xiàn)BMSCs特定方向分化的示蹤，基于磁性物質(zhì)內(nèi)源性鐵MRI成像成為研究的首選報告基因。有研究者通過構(gòu)建神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）啟動子驅(qū)動FTH1基因表達的慢病毒（NSE-FTH1）載體并轉(zhuǎn)染BMSCs，并將轉(zhuǎn)基因BMSCs誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，檢測其FTH1的表達及MRI信號變化，研究NSE啟動子驅(qū)動FTH1基因表達的變化并利用MRI成像監(jiān)測BMSCs向神經(jīng)細胞分化的可行性，結(jié)果顯示，NSE啟動子在BMSCs向神經(jīng)細胞分化的過程中能特異性地啟動報告基因FTH1表達，并且MRI信號也發(fā)生改變，作者認為基于NSE啟動子報告基因內(nèi)源性鐵MRI成像可用于BMSCs向神經(jīng)細胞分化的監(jiān)測[24]?？梢姡ㄟ^基因轉(zhuǎn)染技術實現(xiàn)BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像是可以實現(xiàn)的，但特異性高表達基因的啟動子的尋找是實現(xiàn)BMSCs定向分化過程中分化示蹤的關鍵。

2.2 調(diào)控表達報告基因BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像 報告基因成像技術雖然可以實現(xiàn)BMSCs定向分化示蹤，但是這時的BMSCs分化是人為啟動的、非正常BMSCs生理狀態(tài)下、非自然發(fā)生的，人為干預可能改變BMSCs的生物學行為。有研究采用四環(huán)素誘導Tet-On/Tet-Off基因表達調(diào)控系統(tǒng)，攜帶自殺基因治療間變型甲狀腺癌，取得良好的效果[25]。利用這個思路，可利用四環(huán)素衍生物強力霉素作為通用誘導啟動子調(diào)控跨膜蛋白如NIS或TfR、FTH目的基因的表達, 且可以有效調(diào)控基因表達的時間和水平[26-28]，即當BMSCs在特定微環(huán)境下發(fā)生定向分化時啟動目的基因的表達，實現(xiàn)BMSCs分化示蹤。因此可以進行如下設計：可以將NIS和TfR、FTH基因整合到Tet-On/Tet-Off基因表達調(diào)控系統(tǒng)中作為載體，基因轉(zhuǎn)染BMSCs，通過強力霉素作為誘導啟動子，在BMSCs開始分化的時間段內(nèi)開啟NIS或TfR基因的表達，并進行多模態(tài)分子影像成像，通過對成像規(guī)律的總結(jié)與分子生物學結(jié)果的互證實現(xiàn)對BMSCs分化的在體示蹤監(jiān)測。但BMSCs體外細胞學容易觀察到定向分化時間，而在體動物模型或人體中難以準確觀察到定向分化時間。這就需要用到篩選BMSCs定向分化最終細胞與BMSCs的分子生物標志物的差異技術。

2.3 自動調(diào)控表達報告基因BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像 采用荷肝癌鼠血清作為誘導刺激培養(yǎng)基，體外誘導培養(yǎng)BMSCs，miRNA 微陣列技術分析BMSCs表達譜的差異，篩選差異最顯著的miRNA，將顯著變化的miRNAs輸入miRNA數(shù)據(jù)庫進行下游目的基因的預測。在體動物模型根據(jù)該目的基因表達相應蛋白水平將其作為指示因子（非啟動子），啟動Tet-On/Tet-Off基因表達調(diào)控系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因（如NIS和TfR、FTH）表達[29]，進行在體分子影像學BMSCs示蹤成像。更進一步設計，并在此基礎上，探索設計特異性啟動子（specific promoter），當目的基因表達出現(xiàn)差異時，該特異性啟動子啟動靶基因（如NIS或TfR、FTH）的表達，進行MRI分子影像學成像，觀察成像規(guī)律，實現(xiàn)在體BMSCs定向分化的在體示蹤。

雖然通過這種設計，理論上可以實現(xiàn)BMSCs的分化的自動示蹤，但也存在諸多問題，比如BMSCs內(nèi)轉(zhuǎn)染多種生物活性因子后，對BMSCs的定向分化是否會有影響？對干細胞的生物活性是否存在影響？由此可見，實現(xiàn)BMSCs的在體分化示蹤需要多種生物技術進行合力攻關。

目前，BMSCs遷移、分布、定位的在體示蹤技術通過合適的標記技術基本可以實現(xiàn)，尤其是通過基因修飾實現(xiàn)多模態(tài)分子影像成像成為可能。相比較而言，BMSCs分化的在體多模態(tài)分子影像示蹤技術實現(xiàn)較為困難，主要與靶分子的標記、分化后的降解、設備的分辨率有關，但通過多種生物學技術的合理應用將有望實現(xiàn)BMSCs在體分化的多模態(tài)分子影像示蹤。設計簡單易行、特異性強、靈敏度高、細胞毒性低、受外界干擾小以及移植干細胞的長期定量等優(yōu)點的內(nèi)、外源分子影像探針是科研攻關的目標。