劉孝賀，仇貴生，佟兆國(guó)，張懷江，閆文濤，岳強(qiáng)，孫麗娜

桃小食心蟲(chóng)化學(xué)感受蛋白CSP16配體結(jié)合特性

劉孝賀1，仇貴生1，佟兆國(guó)2，張懷江1，閆文濤1，岳強(qiáng)1，孫麗娜1

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，遼寧興城 125100；2西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013

【】桃小食心蟲(chóng)（）是我國(guó)北方果樹(shù)生產(chǎn)中的重要害蟲(chóng)之一，本文通過(guò)體外表達(dá)桃小食心蟲(chóng)化學(xué)感受蛋白CsasCSP16，明確其與寄主揮發(fā)物分子和性信息素分子的結(jié)合特性，并通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CsasCSP16與揮發(fā)物分子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，為揭示桃小食心蟲(chóng)嗅覺(jué)的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得CsasCSP16蛋白，并使用Ni-NTA柱純化重組蛋白。采用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方法，以N-苯基-1-萘胺（N-pheny-1-naphthylamine，1-NPN）為熒光探針，從33種寄主揮發(fā)物和2種性信息素分子中篩選出與CsasCSP16結(jié)合親和性高的配體分子。通過(guò)對(duì)CsasCSP16進(jìn)行同源建模獲得其三維結(jié)構(gòu)模型，以CSPMbraA6（PDB ID：1N8U）為模板成功構(gòu)建CsasCSP16的三維結(jié)構(gòu)模型。使用Autodock Vina軟件將CsasCSP16與親和性高的配體分子進(jìn)行對(duì)接，構(gòu)建蛋白-配體復(fù)合物。然后使用GROMACS（2019.3）軟件對(duì)復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，從動(dòng)力學(xué)模擬的平衡狀態(tài)中選取100個(gè)構(gòu)象，使用g_mmpbsa軟件計(jì)算CsasCSP16與氣味分子的結(jié)合能，并通過(guò)能量分解的方法預(yù)測(cè)關(guān)鍵氨基酸殘基。成功構(gòu)建了CsasCSP16的克隆表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高純度的重組蛋白。與35種配體分子的熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯有較強(qiáng)的結(jié)合活性，其Ki值分別為6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L-1。分子對(duì)接的結(jié)果表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯的Vina Score值分別為-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，CsasCSP16與氣味分子復(fù)合物在50 ns內(nèi)達(dá)到平衡狀態(tài)，通過(guò)g_mmpbsa計(jì)算復(fù)合物的結(jié)合能，CsasCSP16-水楊酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的結(jié)合自由能分別為-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol-1；最后，通過(guò)分解每個(gè)氨基酸貢獻(xiàn)的結(jié)合自由能表明異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）貢獻(xiàn)的結(jié)合能＞3 kJ·mol-1，因此推測(cè)這4種氨基酸在CsasCSP16結(jié)合氣味分子的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。桃小食心蟲(chóng)CsasCSP16能與寄主植物的多種氣味分子結(jié)合，推測(cè)其可能在桃小食心蟲(chóng)對(duì)寄主植物的定位過(guò)程中發(fā)揮重要作用。異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16與配體分子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

桃小食心蟲(chóng)；化學(xué)感受蛋白；原核表達(dá)；熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；分子對(duì)接；動(dòng)力學(xué)模擬

0 引言

【研究意義】桃小食心蟲(chóng)（）屬鱗翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposidae），雌蟲(chóng)將卵產(chǎn)在蘋(píng)果、桃、梨、山楂等果實(shí)的萼洼處或者果面，幼蟲(chóng)孵化后蛀入果實(shí)內(nèi)部縱橫串食，造成“豆沙餡”似的蟲(chóng)果，給果農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前對(duì)桃小食心蟲(chóng)的防控主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但是大量化學(xué)農(nóng)藥的使用導(dǎo)致天敵被誤殺并引起環(huán)境問(wèn)題。隨著對(duì)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)機(jī)制研究的逐漸深入，引誘劑和趨避劑的開(kāi)發(fā)為害蟲(chóng)防控提供了新的思路和策略。研究桃小食心蟲(chóng)化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein，CSP）與寄主揮發(fā)物的識(shí)別和結(jié)合分子機(jī)制，對(duì)明確該蟲(chóng)產(chǎn)卵定位和取食選擇以及建立基于昆蟲(chóng)行為學(xué)的生態(tài)防控具有重要理論意義。【前人研究進(jìn)展】嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)生理活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如定位產(chǎn)卵場(chǎng)所、尋找寄主植物和避免天敵危害等[2-3]。氣味受體（odorant receptor，OR）或離子型受體（ionotropic receptor，IR）具有分辨和識(shí)別不同氣味信號(hào)的功能。然而，疏水性的氣味分子到達(dá)神經(jīng)元樹(shù)突激活氣味受體或離子型受體之前，通常需要與氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）或化學(xué)感受蛋白相結(jié)合以復(fù)合物的形式穿過(guò)親水性的淋巴液，到達(dá)嗅覺(jué)神經(jīng)元附近刺激嗅覺(jué)受體，化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)[4]。盡管OBP或CSP在嗅覺(jué)形成過(guò)程中的具體功能尚未完全探明，但是，在基因組和轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)大量的OBP和CSP基因可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-8]。CSP通常由100—120個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)緊湊，主要由6個(gè)-螺旋形成一個(gè)疏水性的空腔。不同種類昆蟲(chóng)的CSP都含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，會(huì)形成兩個(gè)二硫鍵用以保持CSP三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[9-10]。與OBP相比，CSP除了具有嗅覺(jué)功能外，還具有其他生理功能。CSP被鑒定出分布在不同的組織中。CSP首先在黑腹果蠅（）中被發(fā)現(xiàn)，命名為OS-D和A10，但當(dāng)時(shí)關(guān)于CSP的功能還不清楚[11]。目前，有關(guān)CSP功能的信息在許多昆蟲(chóng)中得到驗(yàn)證。（1）CSP參與昆蟲(chóng)的再生和發(fā)育。在螳螂中，CSP10參與螳螂若蟲(chóng)斷足的再生；蜜蜂的CSP5與受精卵和表皮的發(fā)育有關(guān)[12-13]。（2）使用亞致死濃度的菊酯類農(nóng)藥處理小菜蛾（）的研究中發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)CSP（CSP3、CSP4和CSP8）基因表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)CSP參與昆蟲(chóng)抗藥性的形成[14-15]。（3）蝗蟲(chóng)由散居型變成聚居型時(shí)，體內(nèi)的CSP基因表達(dá)量提高，CSP可能與蝗蟲(chóng)的聚集狀態(tài)改變有關(guān)[16]。（4）一些CSP在昆蟲(chóng)喙和眼中作為營(yíng)養(yǎng)吸收和視覺(jué)色素的載體[17]。（5）有研究表明，CSP在性腺或生殖器官中結(jié)合化學(xué)信息素信號(hào)，并協(xié)助它們釋放到環(huán)境中[18-20]。最后，CSP結(jié)合氣味分子和信息素分子，參與昆蟲(chóng)嗅覺(jué)的形成過(guò)程，CSP在蚊類的淋巴液中富集并且對(duì)化學(xué)信息素具有很高的親和性；在蜜蜂觸角中高表達(dá)的CSP3可以與信息素結(jié)合[21]。CSP如此廣泛的表達(dá)譜和結(jié)合譜說(shuō)明其在昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。因此，有關(guān)CSP的具體生理功能需要深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者所在課題組前期從桃小食心蟲(chóng)的觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定29個(gè)OBP基因，并發(fā)現(xiàn)2個(gè)GOBP和3個(gè)PBP基因，研究結(jié)果表明酯類、醛類和萜類等氣味分子是潛在的吸引物質(zhì)[22-23]。前期研究發(fā)現(xiàn)，CsasCSP16在雌、雄成蟲(chóng)的觸角和翅中均有表達(dá)[24]。本研究采用原核表達(dá)和熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，研究CsasCSP16與35種小分子化合物的結(jié)合特性。使用分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，預(yù)測(cè)CsasCSP16與小分子結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究桃小食心蟲(chóng)CsasCSP16與相關(guān)化合物的結(jié)合特性，并通過(guò)三維建模和分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究CsasCSP16與配體結(jié)合的分子機(jī)制，為桃小食心蟲(chóng)的綠色防控技術(shù)提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年7月至2020年3月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

供試種群于2018年7月采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所（40.61°N，120.73°E）試驗(yàn)園。采集被桃小食心蟲(chóng)幼蟲(chóng)蛀入帶有“淚滴”危害狀的金冠蘋(píng)果，帶回實(shí)驗(yàn)室，于（25±1）℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期L﹕D=15 h﹕9 h條件下飼養(yǎng)[25]。

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

分別取桃小食心蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)全蟲(chóng)以及觸角（100對(duì)）、頭部（去觸角，20頭）、胸部（10個(gè)）、腹部（10個(gè)）、足（20頭×6對(duì)）、翅（20對(duì)）等組織，按照TRIzol（TaKaRa）試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用RNase-free水溶解，在檢測(cè)其濃度和純度后，再根據(jù)Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real-time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3 重組蛋白的原核表達(dá)和純化

根據(jù)CsasCSP16的開(kāi)放閱讀框序列[24]，于http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站預(yù)測(cè)信號(hào)肽，去除信號(hào)肽后，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)HI正向引物和RI的反向引物，分別為CGATGCGCCC CGAAGAGCACT和TGTTATGGCCTTGAC GGTGCG。純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-19T 載體，測(cè)序成功的pMD-19T/質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行雙酶切，按照T4 DNA連接酶試劑盒說(shuō)明書(shū)將目的片段連接到pET-28a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）大腸桿菌細(xì)胞中，并將陽(yáng)性菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。當(dāng)LB培養(yǎng)基的OD600值達(dá)到0.6—0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。通過(guò)離心（8 000×，4℃，20 min）收集菌體并進(jìn)行超聲處理（100 W，超聲16 min），收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白主要在包涵體中，用10 ml的無(wú)咪唑的8 mol·L-1尿素溶液重懸分散沉淀，在冰水浴下100 W超聲10 min，留20 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，4℃，5 000 r/min離心15 min收集上清[26]。

使用Ni-NTA親和層析柱對(duì)表達(dá)在沉淀中的重組蛋白進(jìn)行純化后，放入透析袋中，經(jīng)過(guò)（6、4、3、2、1、0 mol·L-1）梯度尿素緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，每種梯度透析2 h[27]。透析緩沖液配方：5%甘油，1% L型精氨酸，0.1 mol·L-1EDTA，尿素，使用1×PBS溶解。

1.4 熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)

N-苯基-1-萘胺（1-NPN）用作CSP結(jié)合親和性研究的探針，選擇35種小分子化合物，包括33種蘋(píng)果揮發(fā)物和2種桃小食心蟲(chóng)信息素組分。使用色譜級(jí)甲醇將1-NPN和氣味物質(zhì)配制成1 mmol·L-1的工作液，蛋白用50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）稀釋成2 μmol·L-1，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為337 nm，掃描發(fā)射光波長(zhǎng)范圍350—600 nm。在濃度為2 μmol·L-1的CsasCSP16蛋白溶液中，逐一加入終濃度為0—20 μmol·L-1的1-NPN，直至熒光強(qiáng)度達(dá)到飽和，根據(jù)Scatchard方程計(jì)算CsasCSP16與1-NPN的結(jié)合常數(shù)。然后測(cè)定氣味物質(zhì)與CsasCSP16的結(jié)合能力。將氣味物質(zhì)加入CsasCSP16與1-NPN的混合液體系中，氣味標(biāo)樣濃度依次從2 μmol·L-1梯度遞增。每種氣味物質(zhì)重復(fù)測(cè)試3次。使用公式Ki= [IC50]/（1+[1-NPN]/K1-NPN）計(jì)算結(jié)合常數(shù)，其中IC50為熒光強(qiáng)度降至一半時(shí)加入的配基濃度，[1-NPN]是游離的1-NPN濃度，K1-NPN為重組蛋白CsasCSP16與1-NPN的結(jié)合常數(shù)[27]。

1.5 同源建模和分子對(duì)接

使用Modeller（version-9.19）構(gòu)建CsasCSP16的三維結(jié)構(gòu)模型，選擇CsasCSP16的氨基酸序列作為探針在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)的R-因子、序列連續(xù)性和結(jié)構(gòu)相似性選擇最佳模板。使用Align2D軟件比對(duì)CsasCSP16與模板序列。Modeller中的自動(dòng)建模程序生成100個(gè)構(gòu)象，首先用共軛梯度法（conjugate gradient，CG）優(yōu)化每個(gè)構(gòu)象。其次使用DOPE（discrete optimized protein energy）值來(lái)衡量CsasCSP16構(gòu)象的穩(wěn)定性，最后使用Profile-3D方法和在線工具Swiss-model（https://swissmodel.expasy. org/assess）生成拉氏圖評(píng)價(jià)三維模型的合理性。

運(yùn)用openbabel（https://sourceforge.net/projects/ openbabel/）工具將氣味分子轉(zhuǎn)換為pdb格式，并使用Autodock tools對(duì)氣味分子去水加氫。使用Autodock vina 軟件構(gòu)建CsasCSP16與配體分子的蛋白復(fù)合物[28]。運(yùn)用Autodock tool 1.5.7軟件包對(duì)CsasCSP16蛋白去水加氫，并生成坐標(biāo)文件保存為PDBQT格式。配體分子結(jié)構(gòu)的鍵設(shè)定為任意旋轉(zhuǎn)，設(shè)定網(wǎng)格參數(shù)為40點(diǎn)×40點(diǎn)×40點(diǎn)，格點(diǎn)間距為0.0375 nm，采用CB-DOCK軟件預(yù)測(cè)CsasCSP16表明可能的結(jié)合口袋，選擇前5個(gè)結(jié)合口袋進(jìn)行對(duì)接[29]。通過(guò)局部能量搜索和拉馬克遺傳算法相結(jié)合的方法尋找對(duì)接構(gòu)象。選擇默認(rèn)的Vina-score作為打分值。最終，采用vina-score評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果。使用PyMOL-2.3.0（http:// www.pymol.org/）顯示對(duì)接結(jié)果。

1.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用GROMACS（2019.3）進(jìn)行能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)模擬[30]。蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使用CHARMM36力場(chǎng)自動(dòng)生成[31]。配體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)使用CGenFF服務(wù)器（https://cgenff.umaryland.edu/）生成。進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬每個(gè)系統(tǒng)在截?cái)喟嗣骟w周期邊界條件下使用TIP3P水模型進(jìn)行溶劑化，截止距離為10，其中包含簡(jiǎn)單電荷模型（sample point charge，SPC）的水分子，并在體系中加入抗衡離子（Na+和Cl-）使體系保持電中性。首先采用最陡下降法對(duì)復(fù)合物進(jìn)行50 000步能量?jī)?yōu)化，消除能量重疊。然后分別進(jìn)行100 ps的正則系綜（NVT）和100 ps的等溫等壓系綜（NPT）模擬，使體系溫度保持在300 K，壓強(qiáng)保持在1×10-5pa的平衡狀態(tài)，采用周期性邊界條件和PME（Particle Mesh Ewald）方法處理長(zhǎng)程靜電作用。通過(guò)V-rescale和Parrinello Rahman控制系統(tǒng)的溫度和壓力。使用LINCS算法固定所有原子之間的相對(duì)距離。模擬過(guò)程中采用的步長(zhǎng)為2 fs，每1 ps保存一次軌跡用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。CsasCSP16復(fù)合物動(dòng)力學(xué)模擬的質(zhì)量由主鏈原子的均方根位移（root mean square deviation，RMSD）評(píng)價(jià)。

1.7 CsasCSP16蛋白復(fù)合物結(jié)合自由能計(jì)算

從分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中得到的配體與受體蛋白的相對(duì)結(jié)合自由能通常比分子對(duì)接得分具有更高的試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性[32]。運(yùn)用MM-PBSA方法計(jì)算得到CsasCSP16與配體分子之間的相對(duì)結(jié)合自由能ΔGbind[33]。

ΔGbind=ΔH-TΔS≈ΔEMM+ΔGsol-TΔS （1）

ΔEMM=ΔEint-ΔEele+ΔEvdW（2）

ΔGsol=ΔGPB+ΔGSA（3）

相對(duì)結(jié)合自由能計(jì)算中熵的變化可以忽略，ΔEint為配體與蛋白間的相互作用，ΔEele為靜電作用力，ΔEvdW為范德華力，ΔGsol為溶劑化作用，ΔGPB為極性溶劑化作用，ΔGSA為非極性溶劑化作用。非極性化與極性化作用計(jì)算采用APBS軟件，溶劑的介電常數(shù)設(shè)為80，復(fù)合物的介電常數(shù)設(shè)為1。從分子動(dòng)力學(xué)模擬40—50 ns軌跡中每隔100 ps取一個(gè)構(gòu)象，獲得相對(duì)結(jié)合自由能值，配體分子與CsasCSP16蛋白的相對(duì)結(jié)合自由能表明配體與蛋白結(jié)合能力的強(qiáng)弱，也反映配體分子存在于活性口袋中保持穩(wěn)定性的能力，這種能力往往是決定CsasCSP16與配體分子是否結(jié)合的關(guān)鍵因素。

1.8 CsasCSP16蛋白質(zhì)復(fù)合物關(guān)鍵氨基酸能量分解

基于殘基分解的方法，對(duì)配體分子與氨基酸殘基之間的相互作用進(jìn)行分析，定性描述配體分子與CsasCSP16的結(jié)合機(jī)理[34]。復(fù)合物中每個(gè)殘基分解能可以進(jìn)一步分解為主鏈、側(cè)鏈和總的分解能。每個(gè)配體分子-殘基對(duì)（ΔGCsasCSP16-residue）的相互作用表示為：

ΔGCsasCSP16-residue=ΔEint-TΔS+ΔEvdW+ΔEele+ΔGPB+ ΔGCAVITY（4）

使用g_mmpbsa計(jì)算出配體分子與每個(gè)CsasCSP16殘基之間的范德華力（ΔEvdW）和靜電作用力（ΔEele）。ΔGPB表示由PB模型計(jì)算得出的對(duì)溶劑化自由能的靜電貢獻(xiàn)。通過(guò)基于相應(yīng)SASA的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ瞳@得了對(duì)溶劑化自由能（ΔGCAVITY）的非極性貢獻(xiàn)。內(nèi)部能量（ΔEint）為零，因?yàn)樗趩蝹€(gè)軌跡并且忽略了熵項(xiàng)（TΔS）。PB非極性溶劑化能量目前不可分解。

2 結(jié)果

2.1 CsasCSP16重組蛋白的表達(dá)與純化

通過(guò)終濃度為1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)結(jié)果顯示，在14 kD左右出現(xiàn)一條蛋白條帶。SDS-PAGE電泳顯示CsasCSP16重組蛋白主要在包涵體中表達(dá)，因此對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性處理后過(guò)柱純化獲得了CsasCSP16重組蛋白。在SDS-PAGE條帶上的大小與預(yù)測(cè)的分子量大小一致（圖1）。

2.2 CsasCSP16與配基的結(jié)合

為了進(jìn)一步確定CsasCSP16在嗅覺(jué)方面的潛在作用，選擇33種氣味的化合物和2種信息素作為配體，運(yùn)用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證CsasCSP16的結(jié)合特性（表1）。熒光探針1-NPN與CsasCSP16有良好的結(jié)合特性，其解離常數(shù)（Kd）為9.408 μmol·L-1，表明1-NPN可用于后續(xù)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。根據(jù)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線（圖2）計(jì)算出CsasCSP16與配體分子結(jié)合的IC50和Ki值。結(jié)果表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯有較強(qiáng)的結(jié)合活性，其Ki值分別為6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L-1。

A：CsasCSP16 cDNA核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，信號(hào)肽序列用下劃線標(biāo)注，保守的半胱氨酸殘基用圓圈標(biāo)注，終止密碼子用星號(hào)表示 Nucleotide and deduced amino acid sequence of CsasCSP14 cDNA. Signal peptide is underlined, conserved cysteine residues are marked in circles, the stop codons are denoted by asterisks [25]。B：CsasCSP16在大腸桿菌中的表達(dá)Induciton of the CsasCSP16 in E. coli；1：蛋白分子量標(biāo)簽 Protein molecular weight marker；4：未誘導(dǎo)對(duì)照組 Control group without induction；2、3和5：IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物 Expressed products induced by IPTG。C：超聲破菌結(jié)果The result of sonication；1：蛋白分子量標(biāo)簽 Protein molecular weight marker；2：重組菌的上清蛋白The soluble fraction of recombinant E. coli；3：包涵體 Inclusion body。D：CsasCSP16重組蛋白的純化Purification of the CsasCSP16 recombinant protein；1：蛋白分子量標(biāo)簽 Protein molecular weight marker；2：上柱前蛋白 The proteins before purified by NTA-Ni affinity chromatography；3：流出液Outflow；4：30 mmol·L -1咪唑Imidazole at 30 mmol·L -1；5：300 mmol·L-1咪唑Imidazole at 300 mmol·L-1

2.3 CsasCSP16蛋白質(zhì)三維模型構(gòu)建

選擇一致性（69%）最高的CSPMbraA6（登錄號(hào)：1N8U）晶體結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建CsasCSP16蛋白質(zhì)的三維模型（圖3）。拉氏圖評(píng)價(jià)結(jié)果表明有94.4%的氨基酸殘基在最適區(qū)域內(nèi)，5.6%的氨基酸殘基在允許區(qū)域內(nèi)（圖 4）。Profile-3D的方法得到Verify Score值為37.81，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于要求的最低Verify Score值。CsasCSP16與CSPMbraA6疊合非常好，RMSD值為0.159（圖3-B）。綜上，CsasCSP16的分子三維模型是合理的，可用于后續(xù)的研究工作。

將CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯5種氣味分子進(jìn)行分子對(duì)接，得到的Vina Score值分別為-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。分子對(duì)接的結(jié)果與試驗(yàn)數(shù)據(jù)相吻合。由CB-DOCK預(yù)測(cè)的結(jié)合口袋得出，5種氣味分子與CsasCSP16的結(jié)合部位均在疏水性結(jié)合腔內(nèi)部的同一位置（圖5）。

2.4 CsasCSP16與氣味分子的動(dòng)力學(xué)模擬

為了使CsasCSP16與配體分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與晶體結(jié)構(gòu)更接近，將CsasCSP16與配體復(fù)合物放置于TIP3P顯性溶劑中進(jìn)行了50 ns的動(dòng)力學(xué)模擬。以CsasCSP16與配體分子在加熱階段的構(gòu)象作為參考結(jié)構(gòu)，使用RMSD值評(píng)估復(fù)合物的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖6所示，CsasCSP16與水楊酸甲酯形成的復(fù)合物在10 ns時(shí)已經(jīng)收斂達(dá)到平衡，RMSD值在0.2 nm左右波動(dòng)；CsasCSP16與6-甲基-5-庚烯-2-酮形成的復(fù)合物在30 ns時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)，RMSD值穩(wěn)定在0.3 nm左右波動(dòng)；CsasCSP16與十五烷形成的復(fù)合物在30 ns時(shí)達(dá)到收斂平衡，RMSD值在0.4 nm左右波動(dòng)，CsasCSP16與十五烷的RMSD值波動(dòng)較大，這可能與十五烷在結(jié)合腔內(nèi)結(jié)構(gòu)變化較大有關(guān)；CsasCSP16與庚酸丁酯在20 ns處達(dá)到收斂平衡，RMSD值穩(wěn)定在0.25 nm左右。由于-蒎烯在形成拓?fù)湮募r(shí)，結(jié)構(gòu)罰分值超過(guò)50，故未能進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬。以上結(jié)果說(shuō)明復(fù)合物已經(jīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果達(dá)到期望值。

A、B：CsasCSP16與1-NPN的結(jié)合Binding curves of CsasCSP16 to 1-NPN；C：CsasCSP16與配體的熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合fluorescence competition of CsasCSP16 with ligands；D：CsasCSP16對(duì)不同氣味物質(zhì)的結(jié)合親和力（以1/Ki表示）的比較Comparison of the binding affinities (indicated by 1/Ki) of CsasCSP16 with different components

深綠色區(qū)域內(nèi)為氨基酸殘基的最佳區(qū)域，綠色區(qū)域內(nèi)為氨基酸殘基較合適的區(qū)域，其他區(qū)域?yàn)榘被釟埢銖?qiáng)許可區(qū)和不合理區(qū)

圖5 CsasCSP16在預(yù)測(cè)的結(jié)合口袋與不同氣味分子結(jié)合模式

圖6 CsasCSP16與配體復(fù)合物主鏈Cα原子RMSD隨時(shí)間變化曲線

表2 CsasCSP16與配體分子的結(jié)合自由能和組分

2.5 結(jié)合自由能

采用MM-PBSA的方法計(jì)算CsasCSP16與配體的結(jié)合自由能[33]。CsasCSP16-水楊酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的結(jié)合自由能分別為-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol-1，顯然CsasCSP16可以與4種配體分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。該結(jié)果與熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)一致。結(jié)合自由能可以反映出哪些能量分項(xiàng)影響配體的親和力。從表2中發(fā)現(xiàn)范德華力能量向提供了主要的驅(qū)動(dòng)力，其次為靜電作用力和非極性溶劑化能。溶劑化自由能非極性部分能提供負(fù)能量，不利于CsasCSP16與配體的結(jié)合，這是由于非極性的溶劑與配體分子相互排斥造成的。殘基與配體的空間結(jié)構(gòu)和相互作用力的類型可以揭示這些氨基酸殘基與配體的關(guān)鍵相互作用。從圖7看出，CsasCSP16與配體分子主要是以范德華力連接在一起，并且水楊酸甲酯與蘇氨酸68（Thr68）形成氫鍵。從CsasCSP16與配體氣味分子三維結(jié)構(gòu)圖（圖8）可以看出，氣味分子大多被包圍在由疏水性氨基酸組成的結(jié)合腔。

2.6 能量分解

使用MM-PBSA方法得到單個(gè)氨基酸殘基水平（per-residue level）的結(jié)合自由能貢獻(xiàn)值，其數(shù)值結(jié)果為單個(gè)氨基酸殘基與配體分子相互作用的總和。單個(gè)殘基能量貢獻(xiàn)詳細(xì)情況如圖9和表3所示，在CsasCSP16與水楊酸甲酯形成的復(fù)合物中，有6個(gè)氨基酸殘基的能量貢獻(xiàn)＞1 kJ·mol-1。其中異亮氨酸49（Ile49）貢獻(xiàn)的能量高達(dá)6.2 kJ·mol-1。相反，酪氨酸28（Tyr28）、谷氨酰胺64（Gln64）和蘇氨酸68（Thr68）不利于水楊酸甲酯的結(jié)合，提供了負(fù)面的能量貢獻(xiàn)；在CsasCSP16與6-甲基-5-庚烯-2-酮形成的復(fù)合物中，有11個(gè)氨基酸殘基貢獻(xiàn)的能量＞1 kJ·mol-1，相反，精氨酸50（Arg50）提供負(fù)面的能量貢獻(xiàn)，這是由于Arg50屬于親水性氨基酸，不利于CsasCSP16與6-甲基-5-庚烯-2-酮形成復(fù)合物。CsasCSP16與十五烷形成的復(fù)合物中，有14個(gè)氨基酸的能量貢獻(xiàn)＞1 kJ·mol-1，精氨酸91（Asp91）和組氨酸94（His94）提供反向結(jié)合的能量。CsasCSP16與庚酸丁酯形成的復(fù)合物中有14個(gè)氨基酸殘基貢獻(xiàn)的能量＞1 kJ·mol-1，利于CsasCSP16與配體相結(jié)合的氨基酸屬于疏水性氨基酸，Ile49、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）貢獻(xiàn)的能量＞3 kJ·mol-1，并且Ile49參與了CsasCSP16與4種氣味分子結(jié)合的過(guò)程，由此可以推斷Ile49、Val71、Ile72和Tyr90可能是CsasCSP16與配體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。

圖7 CsasCSP16與配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基（二維結(jié)構(gòu)）

圖8 CsasCSP16 與配體相互作用的氨基酸殘基（三維結(jié)構(gòu)）

表3 主要?dú)埢鶎?duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)

X軸表示CsasCSP16氨基酸殘基的序號(hào)數(shù)，Y軸表示配體與CsasCSP16氨基酸殘基之間的相互作用能量大小。重要的殘基用相應(yīng)的文字標(biāo)記

3 討論

在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感器中，化學(xué)感受蛋白結(jié)合疏水性的氣味分子，穿過(guò)親水性的淋巴液，傳遞給嗅覺(jué)神經(jīng)元，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。本研究通過(guò)包涵體復(fù)性及Ni-NTA技術(shù)純化得到了較高純度的CsasCSP16蛋白，具有與天然蛋白一致的活性。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，含有His標(biāo)簽的融合蛋白與不帶His標(biāo)簽的融合蛋白對(duì)氣味分子的結(jié)合特性無(wú)影響[17]。結(jié)合特性研究結(jié)果表明，CsasCSP16與水楊酸甲酯、6-甲基-5庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和-蒎烯顯示出較強(qiáng)的結(jié)合特性，推測(cè)CsasCSP16可能是桃小食心蟲(chóng)識(shí)別這些氣味分子的靶標(biāo)基因。在觸角中高表達(dá)的其他昆蟲(chóng)的CSP與寄主揮發(fā)物分子也具有較高的結(jié)合活性。如苜蓿盲蝽（）AlinCSP4與法尼烯、-法尼醇、-紫羅蘭酮有特異性的結(jié)合活性，AlinCSP1與3-己烯醇、2-己烯醛和正戊醛具有特異性結(jié)合的高親和活性[35]。CsasCSP16不僅在觸角中有表達(dá)，在雌、雄成蟲(chóng)翅中的表達(dá)量要高于其他組織，這與蜜蜂CSP3的表達(dá)譜比較一致，在翅中的功能有待于進(jìn)一步研究[36]。ZHOU等研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗（）翅上存在許多化學(xué)感覺(jué)器，推測(cè)在翅中高表達(dá)的化學(xué)感受蛋白與接收寄主揮發(fā)物的次生代謝物有關(guān)[37]。本研究通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)篩選出5個(gè)與CsasCSP16結(jié)合的氣味分子，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效的引誘劑提供了參考依據(jù)。

熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)可辨別CSP與不同氣味分子的結(jié)合能力強(qiáng)弱，為了精確地揭示CSP與氣味分子結(jié)合的具體作用機(jī)制，需要準(zhǔn)確了解蛋白晶體結(jié)構(gòu)。Tian等通過(guò)對(duì)蘋(píng)果蠹蛾（）性信息素結(jié)合蛋白（CpomPBP2）三維建模、分子對(duì)接預(yù)測(cè)了其與35種氣味分子的親和性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CpomPBP2與十二烷醇親和性最高，熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合表明CpomPBP2與十二烷醇抑制常數(shù)（Ki）值最小[38]。Venthur等用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)歐洲葡萄蛾（）性信息素結(jié)合蛋白（LbotPBP1）與11種性信息素分子和6種寄主揮發(fā)物的結(jié)合機(jī)制，發(fā)現(xiàn)十二碳烯是LbotPBP1的最好配體[39]。Fan等在研究禾谷縊管蚜（）RpadOBP3與EBF相互作用的機(jī)制時(shí)，在疏水結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)氨基酸殘基與EBF結(jié)合緊密，分別為色氨酸71（Trp71）、色氨酸68（Trp68）、苯丙氨酸26（Phe26）[40]。這對(duì)于進(jìn)一步研究桃小食心蟲(chóng)CSP與氣味物質(zhì)的作用機(jī)制具有指導(dǎo)性意義。

本研究進(jìn)一步開(kāi)展了CsasCSP16與熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合篩選得到的5種氣味分子的分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯與CsasCSP16的蘇氨酸68（Thr68）殘基之間形成氫鍵。這與Sandler等對(duì)家蠶（）BmorPBP1與蠶蛾醇的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為氫鍵在BmorPBP1專一性識(shí)別性信息素過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[41]。因此，CsasCSP16蛋白能夠特異性識(shí)別水楊酸甲酯。水楊酸甲酯是許多植物的揮發(fā)物，由病蟲(chóng)害誘導(dǎo)產(chǎn)生，且可趨避害蟲(chóng)。如經(jīng)斜紋夜蛾（）危害的水稻產(chǎn)生大量的水楊酸甲酯，可顯著趨避褐飛虱（）[42]。CHEN等研究發(fā)現(xiàn)，白背飛虱（）CfurCSP5與水稻揮發(fā)物水楊酸甲酯也具有高親和性[43]。CsasCSP16與高親和性氣味分子結(jié)合能研究發(fā)現(xiàn)，CsasCSP16-水楊酸甲酯結(jié)合自由能最高，為-50.264 kJ·mol-1，該結(jié)果與熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)一致；CsasCSP16與氣味分子的相互作用力主要是范德華力和疏水作用力，異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）貢獻(xiàn)的結(jié)合能＞3 kJ·mol-1，因此推測(cè)這4種氨基酸在CsasCSP16結(jié)合氣味分子的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在Chen等對(duì)白背飛虱CfurCSP5與水稻揮發(fā)物分子對(duì)接的研究中發(fā)現(xiàn)，CfurCSP5與具有高親和性的氣味分子結(jié)合過(guò)程中亮氨酸44（Leu44）、異亮氨酸64（Ile64）、絲氨酸98（Trp98）和苯丙氨酸101（Phe101）等疏水性氨基酸均參與其中[43]。同樣地，在對(duì)小菜蛾CSPMbraA6與配體的研究中發(fā)現(xiàn)，亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）和色氨酸（Trp）是與配體結(jié)合過(guò)程中的關(guān)鍵氨基酸[9]。因此，推測(cè)CsasCSP16與水楊酸甲酯結(jié)合最關(guān)鍵的氨基酸為異亮氨酸，水楊酸甲酯是否可以用作桃小食心蟲(chóng)尋找寄主的趨避物質(zhì)有待于進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

桃小食心蟲(chóng)CsasCSP16能與寄主植物的5種氣味分子結(jié)合，可能參與桃小食心蟲(chóng)對(duì)寄主揮發(fā)物的識(shí)別。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)異亮氨酸49（Ile49）、纈氨酸71（Val71）、異亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16與配體分子結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。

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Ligands Binding Characteristics of Chemosensory Protein CsasCSP16 of

LIU XiaoHe1, QIU GuiSheng1, TONG ZhaoGuo2, ZHANG HuaiJiang1, YAN WenTao1, YUE Qiang1, SUN LiNa1

1Research institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, Liaoning;2School of Agriculture Science, Xichang University, Xichang 615013, Sichuan

【】is one of the most destructive pests on orchards in north China. The objectives of this study are to get the recombinant CsasCSP16 protein, characterize the binding profiles of CsasCSP16 with some small molecular volatiles from host plants, and predict the key residue between CsasCSP16 and putative ligands. In overall this research possibly lays a theoretical and practical foundation for the understanding of olfactory mechanism in.【】The recombinant protein CsasCSP16 was induced to express by constructing prokaryotic expression system, and purified by using the Ni-NTA agarose affinity column. Then, the fluorescence competitive assay was applied, and N-phenyl-1-naphthylamine (1-NPN) was selected as the fluorescence probe to measure the binding profiles of CsasCSP16 recombinant with 33 host plant volatiles and 2 sex pheromone compounds. The Modeller software was used to build three-dimensional model. CSPMbraA6 (PDB ID: 1N8U) was used as the template for homology modeling of CsasCSP16 protein structure. The modeled structure of CsasCSP16 was docked with 35 selected ligands by Autodock vina. Then, the complexes from above step were introduced to GROMACS (2019.3) to conform the stability. Moreover, the binding energies of the complexes were calculated by g_mmpbsa and the key residues interaction between CsasCSP16 and host volatiles were predicted.【】The recombinant expression vector was successfully constructed, and the recombinant protein of CsasCSP16 with high purity was obtained by bacterial system. Further, competitive fluorescence binding assays with 35 candidate ligands showed that CsasCSP16 had high binding affinities against methyl salicylate, 6-methyl-5-hepten-2-one, pentadecane, butyl heptanoate and-pinene, and the recorded Ki values were 6.59, 6.25, 3.50, 6.73 and 4.47 μmol·L-1, respectively. Ligand docking results revealed that the Vina Scores of CsasCSP16-methyl salicylate, CsasCSP16-6-methyl-5-hepten-2-one, CsasCSP16-pentadecane, CsasCSP16-butyl heptanoate and CsasCSP16--pinene were -6.1, -5.3, -5.8, -5.2 and -6.6, respectively. Finally, the g_mmpbsa analysis demonstrated that the binding energies of CsasCSP16-methyl salicylate, CsasCSP16-6-methyl-5- hepten-2-one, CsasCSP16-pentadecane and CsasCSP16-butyl heptanoate were -50.264, -65.551, -136.035 and -93.805 kJ·mol-1, respectively. Ile49, Val71, Ile72 and Tyr90 contribute energy more than 3 kJ·mol-1, suggesting their key involvement in the function of CsasCSP16. 【】The CsasCSP16 has a certain binding capacity with several odors from host plant volatiles, suggesting that it may play an important role in the localization of host plants. Ile49, Val71, Ile72, and Tyr90 may be the key residues involved in the function of CsasCSP16.

; chemosensory protein (CSP); prokaryotic expression; competitive binding; molecular docking; dynamic simulation

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.007

2020-05-11；

2020-06-22

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0200300）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31601643）

劉孝賀，E-mail：liuxiaoheaye@163.com。通信作者孫麗娜，E-mail：sunlina@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）