時(shí)正媛，曾蔚欣，楊 麗，貝 雷，孫路路#（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 00038；.北京市食品藥品監(jiān)督管理局，北京 00038）

復(fù)方水楊酸甲酯軟膏為常用的醫(yī)院制劑，可用于外傷消腫、肌肉疼痛及凍瘡等的治療，其主要成分為鹽酸麻黃堿和水楊酸甲酯。目前，鹽酸麻黃堿和水楊酸甲酯含量測定的方法主要有熒光分析法[1]、毛細(xì)管氣相色譜法[2-3]及高效液相色譜（HPLC）法[4-7]。為此，筆者參考了相關(guān)文獻(xiàn)[1-7]，建立了雙波長HPLC法同時(shí)測定復(fù)方水楊酸甲酯軟膏中鹽酸麻黃堿和水楊酸甲酯的含量，以為有效控制復(fù)方水楊酸甲酯軟膏的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1260型HPLC儀，包括四元泵、標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）；AG285型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：171241-201007、110707-201011，純度：99.7%、99.4%）；復(fù)方水楊酸甲酯軟膏（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：20140525、20140526、20140528，規(guī)格：20 g/支，每100 g軟膏含鹽酸麻黃堿2.5 g、水楊酸甲酯7.08 g）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸、三乙胺均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：磷酸三乙胺溶液（流動(dòng)相A，取磷酸1 ml，用純化水溶解并稀釋至1 000 ml，加三乙胺1 ml混勻）-乙腈（流動(dòng)相B），梯度洗脫程序見表1；柱溫：室溫；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；檢測波長：鹽酸麻黃堿為207 nm，水楊酸甲酯為304 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯對(duì)照品適量，精密稱定，加無水乙醇溶解并稀釋，制成每1 ml約含鹽酸麻黃堿500 μg、水楊酸甲酯1.416 mg的混合貯備液；精密量取混合貯備液適量，加無水乙醇溶解并稀釋，制成每1 ml約含鹽酸麻黃堿50 μg、水楊酸甲酯0.141 6 mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取復(fù)方水楊酸甲酯0.2 g，置于100 ml量瓶中，加無水乙醇適量，于40～50 ℃水浴加熱，緩慢振搖至溶解，放冷至室溫，加入無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按復(fù)方水楊酸甲酯軟膏處方比例制備不含鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜見圖1。結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯保留時(shí)間處樣品中的輔料與溶劑無干擾，分離度為103.32，理論板數(shù)分別為30 579.36、599 948.01。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品溶液（波長為207 nm）；B.對(duì)照品溶液（波長為304 nm）；C.陰性對(duì)照溶液（波長為207 nm）；D.陰性對(duì)照溶液（波長為304 nm）；E.供試品溶液（波長為207 nm）；F.供試品溶液（波長為304 nm）；1.鹽酸麻黃堿；2.水楊酸甲酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.control solution（at 207 nm）；B.control solution（at 304 nm）；C.negative control solution（at 207 nm）；D.negative control solution（at 304 nm）；E.test sample solution（at 207 nm）；F.test sample solution（at 304 nm）；1.ephedrine hydrochloride；2.methyl salic-ylate

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合貯備液1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0 ml，分別置于100 ml量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，制成系列濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸麻黃酮、水楊酸甲酯的回歸方程分別為y＝24.19x+71.36（r＝0.999 9），y＝30.12x+37.02（r＝0.999 8）。表明鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酸質(zhì)量濃度分別在5.0～150.0、0.014 16～0.424 8 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯峰面積的RSD分別為0.92%、0.63%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140526）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置于0、2、4、6、8 h時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯峰面積的RSD分別為1.20%、0.96%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140526）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯峰面積的RSD分別為1.36%、0.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140526）0.2 g，按其所含鹽酸麻黃堿和水楊酸甲酯量的80%、100%和120%，精密加入一定量的鹽酸麻黃堿、水楊酸甲酯對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of recovery tests（n＝3）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液、對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

復(fù)方水楊酸甲酯軟膏中鹽酸麻黃堿和水楊酸甲酯的紫外吸收特征不同：鹽酸麻黃堿在207 nm波長處有最大吸收，水楊酸甲酯在207、304 nm波長處均有最大吸收，但在207 nm波長處水楊酸甲酯的保留時(shí)間有干擾，不適合用于復(fù)方水楊酸甲酯軟膏中水楊酸甲酯的含量測定。因此，為了同時(shí)測定復(fù)方水楊酸甲酯軟膏中兩種組分的含量，故選擇鹽酸麻黃堿的檢測波長為207 nm、水楊酸甲酯的檢測波長為304 nm。

乳膏基質(zhì)中含有凡士林和司盤80，為了不影響測定且保護(hù)色譜柱，需將其進(jìn)行處理。本研究采用40～50 ℃水浴加熱使基質(zhì)溶解，放冷后過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，提取效果較好。

綜上所述，該方法操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于復(fù)方水楊酸甲酯軟膏的質(zhì)量控制。

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