大鼠骨髓mMSC和RS細(xì)胞肝組織內(nèi)注射對(duì)肝硬化大鼠肝功能及肝臟病變的改善作用觀察

謝麗平，林濤發(fā)，郭子寬，王少揚(yáng)

1 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建福州350001；2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所

肝硬化（hepatic cirrhosis）是由不同病因引起的肝臟慢性、彌漫性改變。目前尚無有效內(nèi)科治療肝硬化的方法，肝移植是目前臨床公認(rèn)最有效的治療方法，但移植價(jià)格昂貴、肝源匱乏等因素限制了其臨床應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有低免疫源性、多向分化潛能、取材方便、來源豐富等優(yōu)勢(shì)，目前已被廣泛用于肝臟疾病的治療中。MSC 是一個(gè)異質(zhì)性的細(xì)胞群體，體外培養(yǎng)可見多數(shù)細(xì)胞為梭形成纖維細(xì)胞和大而扁平細(xì)胞，即成熟MSC（mature MSC，mMSC），同時(shí)還可觀察到一種圓形細(xì)胞，其體積很小、顆粒度很低，命名為快速自我更新細(xì)胞（rapidly self-renewing cell，RS 細(xì)胞），這類細(xì)胞具有更強(qiáng)的多向分化能力［1］，認(rèn)為可能是更原始的干細(xì)胞。mMSC、RS 細(xì)胞是否可用于肝硬化的治療中？2020 年2 月—10 月，我們向肝硬化大鼠肝組織內(nèi)注射mMSC、RS 細(xì)胞，比較其抗肝纖維化的效果有無區(qū)別，同時(shí)體外經(jīng)HGF 誘導(dǎo)培養(yǎng)后通過RT-PCR 測(cè)其ALB、AFP 表達(dá)水平，以期進(jìn)一步探討RS細(xì)胞的肝（樣）細(xì)胞分化能力。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑 6周齡Wistar雄性大鼠36只，2周齡Wistar 雄性大鼠1 只，均購(gòu)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，按實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。Mouse anti-Rat CD31-PE、 CD45-PE、 CD11b/c-PE、 CD86-FITC、CD44-FITC（美國(guó) Becton Dickinson 公司），Human HGF（美國(guó) Peprotech 公司），RNAsimple Total Kit、FastKing One Step RT-PCR Ki（t北京天根生化科技公司），Rat anti-AFP Polyclonal Antibody、Rat anti-ALB Polyclonal Antibody（北京嘉美公司），大鼠源白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、β-Actin引物均由奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 大鼠骨髓mMSC、RS細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 大鼠骨髓MSC分離、培養(yǎng)及鑒定 取2周齡Wistar 雄性大鼠1 只，處死后取脛骨和股骨，剪去骨骺端，DMEM 沖出骨髓液，與 PBS 按 1∶1 混勻，200 目尼龍網(wǎng)過濾，收集至50 mL 離心管，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，105/cm2密度接種于10 mm 培養(yǎng)皿，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右傳代（6 000/cm2傳代）。

將分離培養(yǎng)的細(xì)胞按每流式管1×106分裝，各管分別加入CD45-PE、CD31-PE、CD11b/c-PE 和CD44-FITC、CD86-FITC，另設(shè)1 管陰性對(duì)照（無標(biāo)抗體標(biāo)記），室溫避光 30 min，PBS 洗滌 2 次，流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，Becton Dickinson）檢測(cè)。MSC 體外成脂肪和成骨鑒定按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行［2-3］。接種24 h 時(shí)大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞開始貼壁，72 h 見到少量成纖維樣細(xì)胞（呈長(zhǎng)梭形）及很小的圓形細(xì)胞，培養(yǎng)6 d 后長(zhǎng)梭形細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng)，圓形細(xì)胞增多散布于梭形細(xì)胞之間。流式細(xì)胞分析結(jié)果為，細(xì)胞 CD44 表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，CD31、CD11b/c、CD45 和CD86 表達(dá)均呈陰性。體外成骨誘導(dǎo)經(jīng)堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，而對(duì)照細(xì)胞染色陰性；成脂誘導(dǎo)經(jīng)油紅O 染色呈陽(yáng)性，對(duì)照細(xì)胞染色陰性。最終鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為 MSC［6］。

1.2.2 mMSC、RS 細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)［1］確定mMSC直徑15～50 μm、RS細(xì)胞直徑7 μm，因此將培養(yǎng)鑒定的細(xì)胞通過直徑10 μm 濾膜分離RS、mMSC細(xì)胞，分別收集于2個(gè)無菌試管中。

①采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSC 細(xì)胞表型。分離出 RS 細(xì)胞（直徑＜10 μm）通過流式細(xì)胞儀鑒定CD34、CD31、CD44、CD45、CD73 等表型。直徑＜10 μm 的細(xì)胞 CD44、CD73 表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD31、CD45 表達(dá)陰性，鑒定為 MSC［5］。②取 mMSC、RS 細(xì)胞進(jìn)行CM-Dil 染色，按105/cm2密度接種于培養(yǎng)皿，加入HGF（20 ng/mL），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)基及補(bǔ)充HGF。因RS 細(xì)胞為半貼壁懸浮細(xì)胞，遂將正常貼壁細(xì)胞經(jīng)放射后作為滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d 時(shí)取細(xì)胞進(jìn)行CM-Dil 染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RS細(xì)胞是存活細(xì)胞，具有細(xì)胞活力。

③另取大鼠肝臟細(xì)胞、mMSC 及RS 細(xì)胞，RTPCR 法檢測(cè)細(xì)胞 ALB、AFP。設(shè)計(jì) ALB、AFP、βactin 的 引 物 序 列 ：ALB：5'-AGCACACAAGAGTGAGATCG-3'和 5'-TGTCATCCTTGTGCTGCAGG-3'，323 bp；AFP：5'-AACAGCAGAGTGCTGCAAAC-3'和5'-AGGTTTCGTCCCTCAGAAAG-3'，668 bp；β-actin：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'和5'-AGGAGCCAGGGCAGTAATC-3'，353 bp。收集mMSC、RS細(xì)胞及正常肝組織細(xì)胞，采用RNAsimple Total 試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟分離純化總RNA 并檢測(cè)其濃度。RTPCR 步驟根據(jù)FastKing One Step RT-PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行，總反應(yīng)體積 50 μL：2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，上游特異性引物（10 μmol/L）1.25 μL，下游特異性引物（10 μM）1.25 μL，RNA 模板 10 ng/μg total RNA，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)水至 50 μL。擴(kuò)增條件為：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外凝膠成像分析。結(jié)果顯示：肝細(xì)胞表達(dá)ALB、AFP；未經(jīng) HGF 誘導(dǎo)的 mMSC、RS 細(xì)胞及經(jīng) HGF 誘導(dǎo)的mMSC、RS細(xì)胞均不表達(dá)ALB、AFP。

1.3 大鼠肝硬化模型制備、mMSC 和RS 細(xì)胞注射方法 ①模型制備：取 Wistar 大鼠按文獻(xiàn)［4］報(bào)道方法建立肝硬化模型，制備肝硬化大鼠模型共計(jì)6周。6 周后隨機(jī)取3 只大鼠，取肝臟組織做病理學(xué)檢查，可見肝細(xì)胞濁腫，少量脂肪變，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，有大小不等的假小葉形成。②分組：36 只肝硬化大鼠隨機(jī)分為A、B、C 三組。A、B 組大鼠乙醚麻醉成功后開腹，肝組織內(nèi)分別注射mMSC、RS 細(xì)胞，注射細(xì)胞量5×106，治療后即刻關(guān)腹縫合；C 組大鼠開腹后注射NS。治療后三組大鼠繼續(xù)按建模方案喂養(yǎng)。

1.4 各組大鼠肝功能指標(biāo)及肝臟病理變化觀察分別于治療前和治療1、2、4 周時(shí)，各組大鼠尾靜脈取血1 次（2.5 mL），檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）。治療4 周時(shí)處死三組大鼠，觀察肝臟形態(tài)，取肝組織進(jìn)行病理HE 和Masson 染色，對(duì)肝組織進(jìn)行病理分級(jí)評(píng)分［5］（包括肝纖維化、肝細(xì)胞壞死及脂肪變性評(píng)分）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、TBIL 水平比較 造模成功、治療1 周、治療2 周及治療4 周時(shí)各組大鼠血清ALT、TBIL 水平比較見表 1。與 C 組比較，治療1、2、4 周時(shí) A 及 B 組血清 ALT、TBIL 水平降低（P 均＜0.05）。

表1 造模成功、治療1周、治療2周及治療4周時(shí)各組大鼠血清ALT、TBIL水平（）

表1 造模成功、治療1周、治療2周及治療4周時(shí)各組大鼠血清ALT、TBIL水平（）

組別A組B組C組n ALT（U/L）TBIL（μmol/L）造模成功350.75±11.58 354.07±11.42 353.00±11.53治療1周29.83±10.02 25.83± 3.11 328.53±17.25 12 12 12治療2周45.90±17.10 40.80±23.60 338.00±17.78治療4周50.17±14.00 40.07±16.11 333.67± 8.02造模成功1.78±0.13 1.79±0.09 1.80±0.06治療1周0.33±0.15 0.50±0.26 1.80±0.20治療2周0.30±0.21 0.47±0.21 1.50±0.46治療4周0.70±0.66 0.80±0.20 1.57±0.25

2.2 各組大鼠肝組織病理評(píng)分及病理變化 A 組大鼠肝纖維化、肝細(xì)胞壞死、脂肪變性評(píng)分分別為（2.42 ± 0.51）、（1.92 ± 0.51）、（1.83 ± 0.39）分，病理評(píng)分為（6.25 ± 0.87）分；B 組分別為（2.17 ±0.39）、（1.58 ± 0.51）、（1.75 ± 0.45）及（5.50 ±0.80）分；C 組分別為（3.67 ± 0.49）、（3.17 ± 0.39）、（1.83± 0.58）及（8.75± 1.14）分，與C 組比較，A 及B 組肝纖維化、肝細(xì)胞變性壞死評(píng)分低（P均＜0.05）。C 組的肝臟假小葉形成，肝細(xì)胞水腫變性、壞死（++），見少量脂肪空泡；A、B 組的肝臟假小葉的纖維纖細(xì)，肝細(xì)胞變性、壞死（+），見少量脂肪空泡（圖1）。

圖1 治療4周時(shí)各組肝組織病理變化（HE染色，200×）

3 討論

肝硬化是各種原因?qū)е赂螕p傷終末期臨床表現(xiàn)，肝移植是目前臨床治療肝硬化的唯一手段，但肝源匱乏、費(fèi)用昂貴及移植后排斥反應(yīng)等諸多因素限制了其應(yīng)用。MSC 具有抗肝纖維化的作用，因此MSC可能成為治療肝纖維化、肝硬化的有效手段。

研究［7］發(fā)現(xiàn)，將骨髓MSC（BMSC）細(xì)胞移植植入肝硬化大鼠體內(nèi)，BMSC 細(xì)胞歸巢至肝臟后，首先分化成肝卵圓細(xì)胞，隨后分化成肝（樣）細(xì)胞，并證實(shí)BMSC 分化的肝前體細(xì)胞可減輕肝纖維化。當(dāng)肝硬化患者接受MSC 移植治療后，患者肝功能、終末期肝病模型（MELD）評(píng)分及肝臟儲(chǔ)備功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（Child-Pugh）均明顯恢復(fù)，表明MSC 可改善肝功能及肝纖維化［8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝硬化大鼠給予mMSC、RS細(xì)胞治療后，血清ALT、TBIL水平均下降，同時(shí)病理結(jié)果證實(shí)大鼠肝壞死及肝纖維化情況均得到改善。

MSC 可通過多個(gè)環(huán)節(jié)抑制肝組織纖維化，一方面MSC 分化為肝細(xì)胞或者肝卵圓細(xì)胞促進(jìn)肝臟修復(fù)再生［9］，MSC 植入肝臟后，可能與受損的肝細(xì)胞融合，或者分化為肝（樣）細(xì)胞［10-11］。不管是人源還是鼠源MSC 都可以表達(dá)肝細(xì)胞的某些基因型，因此，MSC 存在分化為肝細(xì)胞的潛能［12-13］。另一方面，MSC 通過旁分泌或產(chǎn)生細(xì)胞因子等機(jī)制抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化，促進(jìn)HSC凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的形成［14］。MSC 與HSC 體外共培養(yǎng)時(shí)，可分泌某些細(xì)胞因子，抑制HSC 的增殖及活性［15］。研究［16］發(fā)現(xiàn)，BMSC 可通過干擾 LPS-TLR4 和 NF-κB 信號(hào)途徑抑制 HSC 的增殖和激活。Cao 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，BMSC 可以抑制 ACTA2 和 HGF 表達(dá)，誘導(dǎo) HSC凋亡。Kim 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，MSC 可能通過 HGF 阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化作用，使α-SMA 陽(yáng)性細(xì)胞的增殖受到抑制，從而抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、增加凋亡，緩解肝纖維化。旁分泌作用的另一機(jī)制，MSC 可以通過分泌前列腺素E2 增加IL-10 的分泌，減少TNF-α、IFN-γ和IL-4水平，從而抑制炎癥，改善肝纖維化［19-20］。MSC 還可以促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)，從而降解EMC 減輕肝纖維化［21］。多數(shù)研究者［22-23］認(rèn)為MSC 抗肝纖維化的機(jī)制是多方面機(jī)制共同作用的結(jié)果，即可能是免疫效應(yīng)及旁分泌的協(xié)同作用，或是肝細(xì)胞分化、旁分泌效應(yīng)、免疫效應(yīng)三者共同發(fā)揮協(xié)同作用。

Colter等［1］在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，MSC多數(shù)為梭形成纖維細(xì)胞和大而扁平細(xì)胞，表面粗糙呈顆粒狀，即成熟MSC（mMSC），當(dāng)MSC在進(jìn)行極低密度接種時(shí)（3/cm2），單細(xì)胞克隆群中出現(xiàn)一種小而圓形的細(xì)胞，將其命名為RS 細(xì)胞，這類細(xì)胞體積小、顆粒度低，增殖迅速。RS 細(xì)胞表達(dá)與mMSC 不同的蛋白和表面抗原，已有研究發(fā)現(xiàn)RS細(xì)胞表面抗原數(shù)表達(dá)比mMSC更少，RS細(xì)胞表達(dá) CD117、KDR 顯著高于 mMSC，表明 RS 細(xì)胞是一種更原始的細(xì)胞，具有更強(qiáng)的多向分化潛能。Javazon 等［24］通過觀察細(xì)胞增殖過程，認(rèn)為RS細(xì)胞是mMSC 的前體細(xì)胞。當(dāng)MSC 以3/cm2密度初始接種時(shí)，培養(yǎng)2周后細(xì)胞擴(kuò)增可達(dá)2 000倍，培養(yǎng)6周增殖可達(dá)2×109倍；而當(dāng)以5 000/cm2高密度接種時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)增15 倍左右后即停止生長(zhǎng)［25］，表明MSC細(xì)胞亞群的組成與細(xì)胞接種的密度及時(shí)間相關(guān)，低密度接種可產(chǎn)生更多的RS細(xì)胞亞群。

綜上所述，肝組織內(nèi)注射mMSC、RS 細(xì)胞的肝硬化大鼠治療后肝功能及肝纖維化均有改善，表明RS 細(xì)胞在改善肝纖維化方面與mMSC 有同樣功能。但我們?cè)诜蛛x鑒定細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，mMSC 和RS 細(xì)胞體外HGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后，RS細(xì)胞沒有向肝（樣）細(xì)胞分化的能力。今后應(yīng)進(jìn)一步探索RS細(xì)胞培養(yǎng)條件，包括細(xì)胞接種密度、時(shí)間和刺激劑種類，以及細(xì)胞輸注途徑、時(shí)機(jī)等，尋找更好的細(xì)胞亞群提高肝硬化治療的效果。