中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)與胰腺疾病的研究進展

謝學文，費書珂

（南華大學附屬第二醫(yī)院 肝膽胰脾外科，湖南 衡陽 421001）

中性粒細胞是外周血白細胞的一種細胞類型，是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。中性粒細胞在機體病原感染部位募集多形核中性粒細胞，通過吞噬作用、脫粒和形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）的方式在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究[1-6]表明，NETs參與了心血管疾病、膽結(jié)石的形成、炎癥、腫瘤等相關(guān)疾病的病理生理過程。本文主要闡述NETs在胰腺疾病中的最新研究進展。

1 NETs 的概述

1.1 NETs 的結(jié)構(gòu)特征

NETs是一種纖維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。NETs在2004年首次被發(fā)現(xiàn)參與捕獲并殺滅病原體，它是以去聚化的染色質(zhì)DNA為骨架和多種蛋白顆粒構(gòu)成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、瓜氨酸化組蛋白（citrullinatedhi stone H3，CitH3）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和髓過氧化物酶（marrow peroxide，MPO）、長正五聚蛋白、抗菌肽LL-37等30多種蛋白和酶。在高分辨率掃描電鏡下，NETs是一個特殊的超微結(jié)構(gòu)，可觀察到NETs既可為線狀、網(wǎng)狀、膜狀或點狀結(jié)構(gòu)，也可為破碎或棉樣結(jié)構(gòu)。NETs中DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和附著蛋白的完整性為其捕獲病原體功能提供保障[7]。

1.2 NETs 的形成

NETs的形成過程是一種有別于細胞壞死和凋亡的特殊細胞死亡程序方式，將這種特殊的方式稱為NETosis[8]，這是一種全新的細胞免疫應(yīng)答方式。NETosis被特定的刺激物作用而產(chǎn)生，其機理可能更多的是細胞因子環(huán)境的副作用，而不是對宿主有益。研究表明，脂多糖、干擾素、佛波酯、病原微生物、缺氧、促炎分子HMGB1、活化的血小板、全身炎癥反應(yīng)綜合征等均可刺激中性粒細胞產(chǎn)生NETs。NETs是通過兩種途徑形成：一是細胞死亡途徑，稱為NETosis。二是非NETosis式，它可以獨立于細胞死亡而發(fā)生。NE Tosis的經(jīng)典途徑需要由NADPH 氧化酶產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），然而在缺乏NADPH氧化酶的 情況下，線粒體ROS產(chǎn)生也可以觸發(fā)NETosis[9]。此外，金黃色葡萄球菌可引起一種非常迅速并無需ROS的NETosis[10-11]，在金黃色葡萄球菌的直接作用下，中性粒細胞的細胞核迅速變圓和濃縮，通過囊泡出芽的方式，釋放出NETs的成分，這個未有ROS參與的過程說明NETs的形成并不一定依賴于ROS的觸發(fā)作用，可以認為這是一種NETosis 的特殊途徑。一直以來，研究者都認為NETosis需要中性粒細胞的破裂死亡，而相關(guān)研究觀察到，在沒有中性粒細胞死亡的情況下，機體也可以觸發(fā)NETosis，這種不同途徑的NETosis打破了中性粒細胞的死亡是NETosis必要條件的觀點[12-14]。當然，這種不同于經(jīng)典途徑的NETosis的具體機制和生理意義還有待闡明。

2 NETs 與胰腺疾病的相關(guān)性

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）、胰腺癌是常見的胰腺疾病。多種因素參與胰腺疾病的發(fā)生發(fā)展，如膽結(jié)石、炎癥和腫瘤等。這些相關(guān)因素導致的胰腺疾病與NETs有著密切的關(guān)系。

2.1 NETs 與急性胰腺炎

2.1.1 NETs 是急性膽源性胰腺炎的發(fā)病機制之一急性膽源性胰腺炎（acute biliary pancreatitis，ABP）是臨床上常見的一種胰腺炎。各種原因引起的膽胰管出口排空不暢是ABP 發(fā)生的重要原因，常見的致病因素包括膽囊結(jié)石、膽管結(jié)石、膽道感染等。各種病因?qū)е碌哪懸裙芘帕鞑粫臣皦毫Ξ惓?，膽汁向胰管反流，胰液引流受阻、胰酶異常活化是導致ABP 發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。最新發(fā)表在“免疫”雜志上的一項新研究[5]表明，膽結(jié)石的組裝需要NETs 才能形成。作者通過熒光顯微鏡觀察到膽汁污泥和膽結(jié)石含有胞外DNA（cfDNA）和中性粒細胞彈性蛋白酶，這表明了膽結(jié)石中含有NETs。作者進一步在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，膽固醇和鈣晶體在與中性粒細胞共同培養(yǎng)時可以快速聚集形成膽結(jié)石。靶向治療NETs 的形成可能成為預防膽結(jié)石高發(fā)人群中膽結(jié)石的一種有吸引力的手段，也可從根源上阻止ABP 的發(fā)生。相關(guān)研究[15]表明，使用長期用于治療高血壓和心肌梗塞的藥物，如美托洛爾，以及針對NETs 形成的PAD4 抑制劑能抑制膽結(jié)石的生長，表明預防膽結(jié)石形成和抑制其生長的藥理學方法是可行的。最近的一項研究[16]還發(fā)現(xiàn)，NETs 可以在人和小鼠的胰管內(nèi)部形成聚集體，從而阻塞胰管并促進AP 的發(fā)生發(fā)展。其他相關(guān)研究[17]也表明，NETs 可能在ABP 中起重要作用。綜上所述，NETs 可促進膽胰管結(jié)石的形成，從而阻塞膽胰管，引起膽汁和胰液反流，最終形成AP。由此可知，NETs 是ABP 的發(fā)病機制之一，抑制NETs 的形成，可減少ABP 的發(fā)生。NETs 可作為膽結(jié)石和ABP 的治療靶點，為治療膽結(jié)石和ABP 提供了新的切入點。

2.1.2 NETs 是AP 病情進展的重要因素AP 是由多種病因引起胰酶大量分泌而導致的胰腺自身消化、水腫、出血及壞死的炎性疾病，目前尚無特效的治療手段。引起炎癥反應(yīng)發(fā)生及加重的關(guān)鍵在于炎癥介質(zhì)和胰蛋白酶的釋放不當[18]。Murthy等[19]發(fā)現(xiàn)，通過檢測AP 患者與AP 模型小鼠的血清，發(fā)現(xiàn)NETs 是AP 的重要介質(zhì)，予以NETs抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）處理AP 小鼠模型，顯著降低了小鼠血清NETs 的CitH3 和胞外游離DNA 的水平，減輕了局部炎癥和全身炎癥以及提高了其存活率，以上實驗結(jié)果說明，NETs 參與了AP 的病情發(fā)展，抑制NETs 的形成，可減輕AP 的損傷。Merza 等[20]制備動物AP 模型，使用免疫熒光檢測法檢測到了大量NETs 的產(chǎn)生，且從體內(nèi)循環(huán)中檢測到了cfDNA 的濃度與CitH3 的表達這二者的增加，也證明了NETs 參與了AP 的發(fā)病過程；脫氧核糖核酸酶（deoxyri bonuclease，DNase）干預處理，可減少NETs 的產(chǎn)生，減輕了胰腺組織和腺泡細胞的損傷，這可能成為治療AP新策略。Madhi 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，給予Abelson 酪氨酸激酶（Abelson tyrosine kinase，c-Abl）抑制劑GZD824 不僅能抑制c-Abl 的激活，而且還能降低AP 動物胰腺中CitH3 和血漿中DNA- 組蛋白復合物的水平。此外，GZD824 還能降低血漿淀粉酶、IL-6 和MMP-9 水平，減少炎癥胰腺水腫、腺泡細胞壞死、出血、CXC 趨化因子形成和中性粒細胞浸潤。綜上所述，NETs 是AP 病情進展的重要因素，抑制NETs 的形成，可降低炎癥因子的釋放，減輕局部炎癥和全身性炎癥，同時可減輕胰腺組織的損傷。

2.2 NETs 與胰腺癌

2.2.1 NETs 促進胰腺癌的增殖胰腺癌是惡性程度較高的消化道腫瘤之一，5年總生存率僅約9%[22]。隨著中國人口老齡化的進展以及居民生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，胰腺癌的發(fā)病率將繼續(xù)增長，成為威脅人類生命健康的重大公共衛(wèi)生問題。胰腺癌細胞與其腫瘤微環(huán)境的互相調(diào)控促進胰腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和化療耐藥[23]。為何胰腺癌會形成免疫抑制微環(huán)境以及如何解除其免疫逃逸狀態(tài)，是近年來胰腺腫瘤免疫研究領(lǐng)域的一個熱點。最新研究[24]表明，NETs 可通過包裹腫瘤細胞，阻止免疫細胞與周圍靶細胞之間的接觸，使它們免受CD8+T 細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞介導的細胞毒性作用。相關(guān)研究[25]表明，NETs 的標記物在胰腺癌小鼠和胰腺癌患者中升高。胰腺癌的主要特點是由于胰腺星狀細胞（stellate cells of the pancreas，PSC）活化而形成致密的纖維化基質(zhì)。近來研究表明，NETs 釋放的DNA 可激活胰腺星狀細胞并增強胰腺腫瘤的生長[26]，而已有研究表明，激活的PSC 會隔離T細胞在腫瘤之外[27-28]，因此，NETs 介導的胰腺星狀細胞纖維化激活可能是免疫抑制腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，該環(huán)境可使腫瘤生長不受有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的影響而減弱。綜上所述，NETs可促進胰腺癌的增殖，抑制NETs 可促使T 細胞和NK 細胞能強有效的殺傷腫瘤細胞，從而抑制胰腺癌的增殖。NETs 也可作為胰腺癌的治療靶點。

2.2.2 NETs 可促進PDAC 的轉(zhuǎn)移腫瘤轉(zhuǎn)移（tumor metastasis）是腫瘤細胞脫離原發(fā)部位，抵達遠處組織或器官繼續(xù)增殖生長的過程。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者病情的惡性進展，對治療癌癥提出了巨大挑戰(zhàn)。目前，越來越多的研究[29-31]表明NETs 可以促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。NETs 通過降解細胞外基質(zhì)、捕獲循環(huán)腫瘤細胞、破壞血管完整性、誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及促進血管生成等幾個方面影響腫瘤侵襲及遠處轉(zhuǎn)移。在中國，胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，在男性中已超過膀胱癌成為排名第7 位的腫瘤，且其致死率在全人群癌癥相關(guān)死亡中同樣排名第7 位[32]，這種高致死率可能由于其侵略性轉(zhuǎn)移性質(zhì)所致。相關(guān)研究表明，NETs 可以通過其特殊的蜘蛛網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)在腫瘤細胞和免疫系統(tǒng)細胞之間形成物理屏障，從而起到抑制其他免疫細胞功能的作用, 從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[33]。癌癥相關(guān)的成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）通過腫瘤與基質(zhì)之間的相互作用促進胰腺導管腺癌的發(fā)展。CAF 是腫瘤微環(huán)境以及轉(zhuǎn)移部位的主要組成部分。此外，研究[34-36]表明，CAF 可通過分泌各種生長因子、細胞因子和趨化因子等來促進腫瘤的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究[37]表明，NETs 通過激活CAF 促進PDAC 中的肝微轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種具備多功 能的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，能夠加快血管內(nèi)皮移動、提高血管滲透性及促進血管生成等，是參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。Bergers 等[38]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠中毛細血管的血管開關(guān)處于靜止狀態(tài)，實驗結(jié)果顯示MMP-9 通過刺激VEGF 去激活血管開關(guān)，促進血管生成，從而促進胰腺癌的轉(zhuǎn)移。最新研究[39]表明，NETs 衍生的HMGB1 似乎增強了癌細胞的惡性程度。血栓調(diào)節(jié)蛋白可降解HMGB1，抑制NETs 的形成，從而防止了胰腺癌向肝臟的轉(zhuǎn)移。總之，NETs 與胰腺癌細胞相互作用，NETs 在胰腺癌細胞的相關(guān)轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。

2.2.3 NETs 促進胰腺癌的血栓形成血栓形成是由于在誘因的作用下，血液有形成分在血管中形成異常血凝塊，造成血管部分或全部栓塞，引起相應(yīng)部位血供障礙，可發(fā)生在體內(nèi)所有血管內(nèi)，靜脈血栓發(fā)生率高于動脈血栓。血栓形成是腫瘤患者常見的并發(fā)癥之一，也是常見死亡原因，惡性腫瘤患者的腫瘤相關(guān)性血栓形成嚴重影響患者的治療和預后。與一般人群相比，癌癥患者的靜脈血栓栓塞（VTE）的風險增加了4% 至7 倍[40]。胰腺癌患者靜脈血栓形成的風險增加，其中高凝狀態(tài)的確切機制仍不清楚。相關(guān)研究表明，NETs 可通過捕獲血小板和促凝性細胞外囊泡來增強血栓形成[41]。在人和動物的血栓中均發(fā)現(xiàn)了NETs 成分，通過敲除小鼠的PAD4 基因證實NETs 不僅是靜脈血栓的組成部分，而且還參與了血栓的形成和維持[42-44]。近來研究表明，在胰腺癌患者中，NETs 可增加其促血栓形成環(huán)境中的致病活性[45]。因此，在胰腺癌患者中，抑制NETs 可能是預防病理性血栓形成的可行方法。相關(guān)研究表明，胰腺癌荷瘤小鼠與對照組相比，中性粒細胞彈性蛋白酶，H3Cit 和無細胞DNA 含量增加；此外，荷瘤小鼠的血栓中中性粒細胞標記Ly6G 的含量增加，H3Cit 和DNA 的含量也更高；重要的是，通過中性粒細胞耗竭或DNase I 給藥，都可以減少荷瘤小鼠的血栓大小；以上數(shù)據(jù)表明，NETs 有助于胰腺癌患者的靜脈血栓形成[46]。相關(guān)研究[47]表明，NETs 可通過刺激血小板和釋放組織因子促進小鼠PDA 的高凝狀態(tài)，氯喹抑制NETs 的形成，降低其高凝狀態(tài)，以上結(jié)果說明了氯喹可降低胰腺癌患者的靜脈血栓栓塞率。韓國學者[48]在62 例胰腺膽道惡性腫瘤患者和30 例健康對照中評估了NETs 標記物和高凝標記物的循環(huán)水平，發(fā)現(xiàn)癌細胞誘導的NETS 形成可增強血液的高凝性和促進癌癥的進展，并表明NETs抑制劑（如PGE1 和抗凝血酶）可能是降低高凝性和癌癥進展的潛在治療劑。綜述所述，NETs 是胰腺癌血栓形成的重要因素，抑制NETs 的形成可降低胰腺癌患者的血液高凝性，減少靜脈血栓的并發(fā)癥，同時可抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。

3 總結(jié)與展望

NETs是近年來研究的熱點，尤其在胰腺疾病中的作用值得關(guān)注。研究表明，NETs是ABP的發(fā)病機制之一，也是ABP病情進展的重要因素；NETs可促進胰腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、以及參與癌靜脈血栓的形成。在AP和胰腺癌的動物模型中應(yīng)用DNase或PAD4抑制劑等藥物，能夠阻止NETs的形成進而減輕AP的損傷，以及消除NETs促進胰腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和靜脈血栓形成等效應(yīng)。因此，深入探究NETs及其抑制劑在胰腺疾病治療中的作用，具有一定研究前景，也能夠為臨床工作提供了新的思路，新的切入點。但是，NETs是否能夠成為臨床上治療AP或胰腺癌的新靶點，仍需要大量的實驗進行研究和探討。