梁少波，張 琳，朱俊峰，劉 朔，彭 程，尹 馨，李金平，侯廣宇，劉華雷，格日勒圖，蔣文明

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古呼和浩特 010018；3.山東農業(yè)大學，山東泰安 271018；4.青島農業(yè)大學，山東青島 266109）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種急性、高度接觸性人獸共患傳染病[1]，根據致病率不同可分為高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，LPAI），其中H7N9 亞型對禽呈現高致病性[2]。1878 年意大利首次報道AI 疫情，后來被證實為H7 亞型[3]。2000—2012年H7 亞型流感全球流行，涉及中國、德國、美國、南非、韓國、墨西哥、澳大利亞、葡萄牙等多個國家。2013 年H7N9 亞型流感在我國部分活禽市場暴發(fā)，僅僅數月蔓延至多個省份，直接經濟損失達65 億元[4]。此次疫情導致養(yǎng)禽業(yè)停滯，禽產品消費份額急速下降，引起了社會各界的廣泛關注。同年，在上海市發(fā)現人H7N9 亞型流感病例，隨后在浙江、江蘇、福建、廣東等地也陸續(xù)發(fā)生人感染病例[4]。2017 年初Shi 等[5]從廣東省活禽市場收集的樣本中檢測到H7N9 亞型流感病毒HA 突變株，研究發(fā)現此類突變株對雞具有高致病性，并且對人同樣具有致病性。2017 年H7N9 亞型流感疫情席卷全國，達到疫情暴發(fā)最高峰[6]。2019 年3 月遼寧省發(fā)生孔雀H7N9 亞型流感疫情，3 月下旬內蒙古出現人H7N9 亞型流感確診病例，這是停止報告14 個月后人間病例的再次出現[7]。2019 年Jiang 等[8]在進行主動AI 監(jiān)測時，鑒定出7 株高致病性H7N9 亞型流感病毒，分析發(fā)現所有分離的病毒與往年明顯不同，提示病毒的變異速度可能在加快。

針對禽間H7N9 亞型流感疫情，2017 年農業(yè)部批準使用（H5+H7）二價滅活疫苗，疫情因而得到有效控制。但近些年H7N9 亞型流感病毒變異速度加快，導致疫情防控難度加劇，至今疫情仍有發(fā)生。近年來，許多科研工作者對不同類型的AI 疫苗進行了探索和嘗試，包括全病毒滅活疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒（VLP）疫苗、流感通用疫苗等。

1 全病毒滅活疫苗

全病毒滅活疫苗具有安全性高、制作工藝簡單、病毒易于培養(yǎng)、免疫原性高、不出現變異、便于運輸儲存等諸多優(yōu)點，目前在我國市場應用非常廣泛。

2014 年國家禽流感參考實驗室選取H7N9亞型流感病毒A/Chicken/Shanghai/S1053/2013（CK/53）為親本毒株，利用反向遺傳技術構建出一株H7N9 亞型流感毒株（rCK/53）作為疫苗候選毒株；2017 年以H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株疫苗種毒為基礎，研制出重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株，簡稱H5+H7 二價滅活疫苗）。吳姣姣等[9]對該疫苗進行了安全性和有效性評估，發(fā)現其對雞、鴨和鵝均可提供良好的臨床保護。2018 年，陳曉涵等[10]將疫苗株進行更新，構建了H5 亞型Re-11 株、Re-12 株和H7 亞 型 H7-Re2 株，利 用Re-11、Re-12 和H7-Re2 株疫苗種毒制備成重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+H5N1 Re-12 株+H7N9 H7-Re2 株），并證明其具有良好的免疫保護效果。該疫苗從2019 年開始在全國推廣應用。2020 年劉艷晶等[11]對重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗（細胞源、H5N1 Re-11 株+Re-12 株、H7N9 H7-Re3 株）進行了評估，發(fā)現細胞源重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗具有良好的免疫原性，能夠完全抵御近期監(jiān)測到的H7N9 亞型及H5N1、H5N6 亞型流感病毒的攻擊。

流感毒株的不斷變異，導致疫苗毒株需要隨之更新，否則全病毒滅活疫苗可能無法保護新變異毒株的攻擊，因此需要更新疫苗母本毒株，以實現全病毒滅活疫苗對變異毒株攻擊的保護。

2 核酸疫苗

2.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗是將編碼某種蛋白質抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體免疫系統(tǒng)，從而誘導特異性體液免疫和細胞免疫應答。DNA 疫苗免疫持續(xù)期長，可誘導較強的特異性體液免疫和細胞免疫，對不同亞型流感病毒具有交叉保護作用，具有與弱毒疫苗相當的免疫原性，但其在動物體內表達效率不穩(wěn)定[12]。

2018 年潘俊慧等[13]針對H7N9 亞型流感病毒，構建了表達A/chicken/Guangxi/SD098/2017 毒株（GX/SD098）HA 蛋白的重組質粒pCA-SD098，同時通過背靠背的優(yōu)化方法，利用雙表達框策略構建了共表達H7N9 和H5N1 亞型流感病毒HA 蛋白的雙價DNA 疫苗質粒pCA-GZ4-SD098，并對構建好的DNA 質粒進行免疫效力評價，發(fā)現pCASD098 能夠100%抵御H7N9 亞型流感病毒的致死性攻擊，雙價DNA 質粒pCA-GZ4-SD098、質粒pCA-SD098 和pCA-GZ4 混合免疫，能同時對H7N9 和H5N1 亞型流感病毒的致死性攻擊提供100%的保護，因而有效降低了感染后的病毒載量。目前已證明，DNA 疫苗具有安全性高、耐受性好、免疫原性好等優(yōu)點，可獲得較高的HI 和中和抗體效價，足以應對流感毒株攻擊，可對動物起到穩(wěn)固的保護作用[12，14]。

2.2 RNA 疫苗

RNA 疫苗是將含有編碼抗原蛋白的RNA 導入人或動物體內直接進行翻譯，形成相應的抗原蛋白，從而誘導機體產生特異性免疫應答，以達到預防免疫作用。Kapil 等[15]將H7N9 亞型流感病毒（A/安徽/1/2013）HA 蛋白mRNA 進行修飾后制備成mRNA 疫苗，結果發(fā)現該疫苗在小鼠、雪貂和非人靈長類動物中產生了強烈的免疫應答，誘導產生了較高的HI 抗體，單劑量免疫即可保護小鼠免受致命性攻擊，并可降低雪貂的肺部病毒滴度。該試驗證實了mRNA 疫苗具有良好的免疫原性和不受種屬差異限制的優(yōu)點。與傳統(tǒng)疫苗相比，mRNA疫苗具有很多優(yōu)勢[16]：其一，mRNA 沒有潛在的感染風險，并且可在體內降解，由此確保了疫苗的安全性；其二，mRNA 翻譯效率高，可誘導高效的免疫應答反應，并可重復接種；其三，mRNA疫苗體外轉化率高，可提升mRNA 疫苗生產速率，因而更具市場競爭力。

3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是將流感病毒的基因，如HA/NA等蛋白基因，克隆到基因表達載體上，利用微生物、哺乳動物等表達系統(tǒng)來產生具有免疫原性的蛋白，然后通過一系列純化得到高純度蛋白，最后加入佐劑制成的。這種疫苗具有很好的安全性，但是免疫原性較低，需要加入佐劑才能刺激機體產生高水平抗體。很多研究已經證明了亞單位疫苗可以產生高滴度的抗體，抵御流感病毒的致死性攻擊[17]。它的局限性也很明顯，重組亞單位疫苗需要找到一個好的表達系統(tǒng)，而表達出具有抗原性的高產蛋白更為關鍵。因此，高質量的疫苗需要成熟的技術支持才能得以應用推廣。

Hasan 等[18]采用電子逆向疫苗策略，設計了一種針對H7N9 亞型流感病毒的獨特嵌合亞單位疫苗。首先篩選出最具抗原性的蛋白質組表位，然后將一個高免疫原性表位與合適的佐劑和連接劑相結合，最后利用反向遺傳技術，開發(fā)出一種獨特的針對H7N9 亞型流感病毒的嵌合亞單位疫苗。經驗證，此疫苗理化性質穩(wěn)定，能夠誘導機體產生細胞免疫應答。

4 VLP 疫苗

VLP 是含有某種病毒一個或多個結構蛋白的顆粒，由表達病毒結構蛋白的細胞自行組裝形成。VLP 模擬了天然病毒的構象表位，具有免疫原性，可誘導產生免疫應答，具有良好的安全性，但其不含病毒核酸因而不能自主復制。目前VLP 常用的表達系統(tǒng)有桿狀病毒、昆蟲細胞、細菌、植物和衍生系統(tǒng)。2019 年Breanna 等[19]研制了基于流感病毒HA 蛋白的植物來源VLP 疫苗，發(fā)現小鼠肌內注射后可引發(fā)體液和細胞免疫反應，保護老齡小鼠免受致命攻擊，并且此疫苗采用噴鼻方式免疫，即可獲得較好的免疫效果。2020 年李如夢等[20]選取了一株H7N9 亞型流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（DG50）作為目的基因供體，構建出基于重組桿狀病毒昆蟲細胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)的H7N9 VLP 新型疫苗。免疫效力試驗顯示：該VLP 疫苗能夠誘導產生較強的免疫反應，針對H7N9 亞型流感病毒攻擊可提供完全的臨床保護且抑制排毒[19]。VLP 疫苗具有生產周期短、制備成本低、安全性高等特點，但其不能100%抑制排毒，使其目前未能應用于臨床，是一種非常具有開發(fā)潛力的流感疫苗。

5 通用流感疫苗

流感病毒主要抗原HA 和 NA 的漂移特性，使得HA/NA 變異速度極快，因此流感防控異常艱難。就國內H7N9 亞型滅活流感疫苗，從2013 年至今，疫苗株已更新了兩次。而通用流感疫苗是一種不依賴HA 和NA，對甲型及乙型流感毒株均具有保護力的新型疫苗[21]，可降低流感防控難度。目前，通用流感疫苗的幾個靶點主要包括HA 的保守莖部、基質蛋白2（M2）以及離子通道的胞外域（M2e）、核蛋白（NP）和基質蛋白（M1）[22]。M2e 和HA 柄結構域是通用流感疫苗設計中最廣泛使用的病毒靶標。它們的保守性和受特異性抗體保護，使其免受異源病毒影響。Daria 等[23]證實了基于M2e 和HA 柄結構域的通用流感疫苗，能誘導產生針對流感病毒保守表位的抗體和T 細胞免疫反應。王文娟等[24]基于NP 和M1 蛋白合成了通用型甲型流感疫苗，免疫小鼠后可以誘導產生較強的體液及細胞免疫應答，用甲型流感A/Beijing/501（H1N1）株、A/PR/8/34（H1N1）株和A/Ostrich/Suzhou/097/2003（H5N1）株進行致死性攻擊后，疫苗免疫組保護率分別為100%、100%和67%，并能降低小鼠肺組織的病理損傷和小鼠組織病毒滴度?？梢援a生交叉免疫保護作用的流感“通用疫苗”對AI 的防控有重要意義，而且流感通用疫苗可在很大程度上降低養(yǎng)殖成本和疫苗研發(fā)投入，應用于臨床疫病防疫一勞永逸。

6 小結

2013 年H7N9 亞型流感疫情在我國發(fā)生，出現人間感染病例。2017 年H7N9 亞型流感毒株由低致病性變異為高致病性，給家禽業(yè)造成了重大經濟損失。鑒于H7N9 亞型流感造成的公共衛(wèi)生事件及其對家禽的影響，2017 年農業(yè)部批準使用（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株）二價滅活疫苗，使AI疫情得到有效控制。目前針對禽間H7N9 亞型流感，我國仍采取監(jiān)測、撲殺及全面接種疫苗的綜合防控策略[25]。在疫苗研究方面，針對新型疫苗，如核酸疫苗、亞單位疫苗、VLP 疫苗等國內科研人員進行了不斷探索和嘗試，并取得了一定進展。相信，隨著疫苗研究的不斷深入，多種新型疫苗會不斷投放市場，這將對我國H7N9 亞型流感的控制和根除起到積極作用。