崔榮飛, 劉 冰，左曉磊，王麗娟, 張東旭

（1.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測中心 050041；2.河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳 050000；3.張家口市宣化區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 075000）

隨著我國經(jīng)濟的不斷發(fā)展，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展逐漸邁向現(xiàn)代化和集約化，養(yǎng)殖密度的加大在很大程度上會導(dǎo)致動物疫病的肆意傳播。根據(jù)河北省動物疫病預(yù)防控制中心幾年來針對本省臨床豬病的監(jiān)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬瘟病毒（CSFV），這四種豬繁殖障礙性病毒病的發(fā)病率情況較為普遍，疫病防控重要性比較突出，而且在臨床上總是表現(xiàn)出混合感染的特點，對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失

1 豬四種繁殖障礙性病毒病的特點

1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，又稱高致病性豬藍耳病，患病豬只的臨床癥狀為繁殖系統(tǒng)發(fā)生障礙（表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)率高達50%～70%、公豬精子數(shù)量降低、大部分新生仔豬表現(xiàn)共濟失調(diào)等）與呼吸系統(tǒng)發(fā)生障礙（表現(xiàn)為日常情況發(fā)生呼吸困難、咽部分泌物增多等），且因病豬呼吸困難導(dǎo)致患病豬只，表現(xiàn)耳尖呈藍紫色，因此俗稱豬藍耳病。該病于1987年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，而后在1991年科研人員在患病豬只分泌液中分離到病原，在此之后該病迅速傳播到了世界各地，導(dǎo)致了非常大的經(jīng)濟損失與社會恐慌。1996年郭寶清在我國境內(nèi)首次分離得到并發(fā)現(xiàn)PRRSV病原，從而表明了豬藍耳病已在我國境內(nèi)傳播，自此至今，該病仍在我國傳播與發(fā)生的速度呈上升趨勢，因此于2008年，我國把豬藍耳病加入了一類動物疫病的行列。

PPRSV是一種二十面體的卵球形正股RNA病毒，病毒最外側(cè)是有著雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的囊膜，其作用是作用包裹保護內(nèi)部的遺傳信息。而內(nèi)部則是病毒的遺傳物質(zhì)，外部圍繞有與囊膜類似的膜結(jié)構(gòu)，膜表面有許多突起。該病毒感染哺乳動物（如豬、馬、牛、羊、鼠和人等）時，不會凝集O型紅細胞；將病毒不具有熱穩(wěn)定性，在56 ℃的溫度下，15～20 min病毒就會失活，將病毒至于4 ℃以上的環(huán)境會令其緩慢失去感染性。通過很多測試結(jié)果表明，PRRSV在低溫下有較好的穩(wěn)定性，而濕度較低、溫度較高的條件則會令病毒失活。PRRSV在pH小于5或大于7的環(huán)境條件下其感染力會迅速下降至10%。由于病毒有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)膜的存在，則用脂溶劑等處理也會導(dǎo)致其失活。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組長度約15 kb，其中共編碼9個開放閱讀框（ORFs），分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b和ORF3～7。其中ORF1a和ORF1b比較大，占基因組的80%，這兩個的作用是編碼病毒的RNA聚合酶。ORF1a的終止密碼子（UAG）的上游包括溴核苷酸的基因序列“UUUAAAC”。在該序列的下游包括一個偽結(jié)結(jié)構(gòu)，對于ORF1b的表達是必需的。ORF2、ORF3和ORF4這三個序列的作用是編碼病毒粒子相關(guān)蛋白，其表達產(chǎn)物分別為GP2、GP3和GP4。然而，經(jīng)過大量實驗表明，ORF3所表達的GP3可能會表達出非病毒粒子相關(guān)蛋白，而表達出可溶性蛋白。ORF5、ORF6和ORF7這三個序列分別編碼糖蛋白GP5、膜蛋白M和核衣殼蛋白N。通過查閱大量文獻表明，ORF5序列可表達一種新的結(jié)構(gòu)蛋白,并將其命名為ORF5a蛋白，對這種新蛋白的功能還不清楚，需要科研人員進一步的研究。M蛋白為非糖基化蛋白，其具有一定的疏水性結(jié)構(gòu)。N蛋白也為非糖基化蛋白。

PRRSV傳播及其迅速，患病豬只在潛伏期傳播2～3個月，就可導(dǎo)致豬群95%以上呈陽性表達，統(tǒng)攬全球幾乎所有的養(yǎng)豬企業(yè)均認為豬藍耳病制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。根據(jù)PRRSV特征的相似性可以將該病毒分為美洲型（American type）和歐洲型（European type），雖然是同種病毒的兩種分型，但它們的基因組的差異可達到40%。就現(xiàn)如今情況來看，PRRSV已傳播到了全球較大的養(yǎng)豬國家，而在我國，流行最廣泛的基因型為北美型。

1.2 豬圓環(huán)病毒2型

Tischer等于1974年，在豬腎細胞PK－15中觀察到圓形顆粒病毒，而且該病毒在不引發(fā)病變的情況下，可持續(xù)感染細胞。Tischer等于1982年，成功分離出病毒粒子和病毒核酸，并表示該圓形顆粒物是一種有二十面體結(jié)構(gòu)的無囊膜、單鏈環(huán)狀的DNA病毒，隨后將它命名為豬圓環(huán)病毒(PCV)，它是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒。PCV共有PCV1，PCV2和PCV3三個血清型，其中PCV1未有報道發(fā)現(xiàn)其有致病性，而PCV2則會引起抑制免疫功能的疾?。ɡ缧律胸i先天性震顫等) ，進而造成并發(fā)感染或繼發(fā)感染。PCV3的感染會引起母豬反制系統(tǒng)障礙，嚴重者會導(dǎo)致死亡。

PCV2，核酸長度1767～1768 nt。PCV在一定程度上可抵抗惡劣環(huán)境，表現(xiàn)在其可于酸性環(huán)境中很長時間不失活，對部分有機溶劑敏感性較低，在高溫情況下也可維持一定時間不失活。但對苯酚、火堿和氧化劑等敏感性較高，25℃情況下使用甲醛消毒10min就可使病毒的活性下降。PCV不可凝結(jié)豬、牛、羊、雞和人的紅細胞。PCV2基因組共有11個開放性閱讀框，其中以O(shè)RF1和ORF2序列為主，ORF1可以編碼Rep蛋白，ORF2可以編碼Cap蛋白，其中ORF1的基因序列相對保守。PCV1和PCV2之間因為其抗原性的不同，使得能夠通過抗原交叉反應(yīng)將二者進行區(qū)分。

PCV2的傳播途徑分為兩類，分別是水平傳播和垂直傳播。水平傳播一般是患病豬和潛伏期或治愈后的帶毒豬，通過呼吸道、消化道傳播；垂直傳播則是患病的妊娠母豬，通過胎盤傳染給仔豬。該病無明確季節(jié)性，有全球流行性，從該病的首次報道至今，在全球范圍內(nèi)PCV2的傳播率逐年上升，在我國，集約化養(yǎng)殖的豬群中PCV2感染同樣很嚴重，由此對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

1.3 豬偽狂犬病病毒

豬偽狂犬病病毒(PRV)，也就是豬皰疹病毒I型，豬感染PRV后主要癥狀為體溫升高、身體騷癢（除豬外）等，并會引發(fā)繁殖系統(tǒng)障礙等狀況，嚴重的會導(dǎo)致死亡。

豬偽狂犬病病毒是一種二十面體的球形結(jié)構(gòu)，由核心、衣殼、皮層以及囊膜共同組成。PRV的核心主要由雙鏈脫氧核糖核苷酸和蛋白質(zhì)所構(gòu)成，并且長度大概在75 nm左右。病毒基因組的長度約為145 kb，DNA上的序列主要分為4個部分，分別是UL（110 kb）、US（9 kb）以及TR和IR兩者共長16 kb，其中G+C含量約為74%。PRV基因組包含的基因達到70多個，編碼的蛋白共70～100種，在所有基因中g(shù) C、g E、g G等是病毒增殖過程中所必需的，其中g(shù) E基因是制備疫苗所需的毒力基因，目前針對PRV的疫苗為g E基因敲除苗。核衣殼的長度大概在100-110 nm左右，并且由162個殼體共同構(gòu)成，其中，還包含衣殼頂部的12個重復(fù)子以及150個六鄰體。除去一個由多分子病毒蛋白UL6 組成的重復(fù)子外，剩下的殼體都是由蛋白質(zhì)VP 5 以及VP26所構(gòu)成的。由UL6 所構(gòu)成的重復(fù)子的主要功能為傳遞病毒的遺傳信息。病毒粒子的皮層可以分成三個部分，分別為內(nèi)層、中層及外層，前兩層結(jié)構(gòu)是一種不具有特定形態(tài)的蛋白薄膜，外層由162個構(gòu)成，由一個VP19c分子以及兩個VP 23分子共同構(gòu)成三聯(lián)體，達到將162個殼粒相互連接的作用。外部為由蛋白質(zhì)形成的內(nèi)膜，膜上存在一些轉(zhuǎn)錄起始因子，VP16（αTIF false）以及能夠促進病毒侵犯宿主細胞的蛋白質(zhì)（vhs）。病毒的最外部分為囊膜，該膜上存在被病毒編碼的糖蛋白，并且在它的表面，可以發(fā)現(xiàn)很多放射狀的纖突，直徑在10 nm左右。

豬偽狂犬病病毒在潛伏期存在的部位是三叉神經(jīng)節(jié)（TG）、嗅球和扁桃體，而且在不產(chǎn)生臨床癥狀的時期病毒不表現(xiàn)侵染性，不過在此期間可通過高度敏感的方法檢測病毒核酸。經(jīng)大量研究表明，在經(jīng)口腔及呼吸道感染后的最初一段時間，PRV侵入該部位的上皮細胞并進行增殖，再次之后PRV就可侵入機體的感覺神經(jīng)末梢。PRV能夠在上皮細胞中繼續(xù)繁殖，產(chǎn)生一系列的子代病毒。隨后，子代病毒對神經(jīng)元進行進一步的攻擊，大大促進了神經(jīng)元感染的可能性。對于上述過程經(jīng)過一系列的研究后發(fā)現(xiàn)，PRV在首次攻擊三叉神經(jīng)節(jié)以及二次感染后，并不能進一步生成子代病毒，它們之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，這在一定程度上說明，病毒在對神經(jīng)元感染的過程中受到一定的限制，這可以說是神經(jīng)元對于多次感染而產(chǎn)生的一種抵抗機制，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，上述機制主要被 PRV中的gK基因所控制的，但對該機制的表達機理尚不清楚。同時，此機制也為科研人員研究增強疫苗免疫功能打開了新的思路。根據(jù)上述機制能夠進一步得出，疫苗的作用不僅可以預(yù)防感染，減毒活疫苗毒株還能夠在一定程度上抑制野毒株的多重感染，進一步防止子代病毒的產(chǎn)生，從而可以抑制PRV的增殖和擴散。

豬偽狂犬病病毒有多類宿主，包括豬、牛、羊、貓、狗、鹿、水貂和狐貍等動物。豬偽狂犬病病毒感染宿主后，消除較為困難，豬一旦感染，不管發(fā)病與否，都將呈現(xiàn)帶毒狀態(tài)，當宿主免疫能力下降時，就會再次發(fā)病，進而感染豬群。PR對母豬和仔豬具有較大的危害，導(dǎo)致集約化養(yǎng)豬場的經(jīng)濟損失。該病在我國的20多個省份都有發(fā)生，但其中多數(shù)呈現(xiàn)散發(fā)性。

1.4 豬瘟病毒

豬瘟(CSF)指的是一累具有高危險性的接觸性傳染病，它的主要特點是傳染性強，并且具有很高的死亡率，由一定的全球流行性，這在一定程度上對于全世界的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了很大的影響，我國將其列為一類傳染病，豬瘟病毒(CSFV)是正股RNA病毒，長度約為12.3kb左右。在十九世紀三十年代，該病于美國的俄亥俄州被人們發(fā)現(xiàn)，隨后便大量被世界各地所報道，現(xiàn)在我國豬瘟的發(fā)病率逐年上漲。患病豬只的發(fā)病情況取決于感染的毒株、患病豬只的年齡以及免疫情況等，豬只在發(fā)病后，主要表現(xiàn)為高熱稽留、皮膚上有大量出血點，臨診上分為急性和慢性。該病還能夠在一定程度上抑制機體的免疫功能，進一步使機體產(chǎn)生感染。

豬瘟病毒直徑約為40～70 nm，核衣殼直徑約29 nm，被雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)包裹，呈球形二十面體，外部有囊膜，囊膜表面可觀察到有許多的纖突結(jié)構(gòu)，長約6～8 nm，豬瘟病毒基因組主要由1個開放閱讀框（ORF）以及2個非編碼區(qū)（5’-NTR和3’-NTR)共同構(gòu)成。開放閱讀框（ORF）可表達出一個有3893個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白在高爾基體內(nèi)加工成為四個結(jié)構(gòu)蛋白和八個非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是C，E0，E1，E2和Npro，P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B,NS5A,NS5。

5’-NTR的單鏈間隔SS介于兩個基序之間。調(diào)查研究表明，SLI和SS核苷酸的損傷會影響病毒的復(fù)制能力。C蛋白不僅是構(gòu)成病毒的蛋白，而且也是調(diào)控基因表達的工具；E0蛋白含有RNase活性，它的C端能夠在豬瘟病毒感染過程中，在一定程度上影響真核細胞膜的遷移，并在一定程度上可抑制RNA誘導(dǎo)細胞反應(yīng)；E1蛋白與E2蛋白形成的復(fù)合蛋白可以幫助病毒穩(wěn)定其構(gòu)型。豬瘟病毒的復(fù)制時需要Npro蛋白的N端蛋白水解酶。P7蛋白可調(diào)控感染性病毒粒子的釋放。NS在細胞產(chǎn)生CPE的過程中起到了一種媒介的作用。

豬感染豬瘟病毒，臨床癥狀為患病豬只高熱稽留，白細胞減少癥，皮膚上有大量出血點等。病毒在侵襲宿主細胞時，是否能夠吸附和進入細胞取決于以上四種結(jié)構(gòu)蛋白，另外，CSFV是否能夠成功侵入細胞還取決于細胞和組織液的PH。然而CSFV暴露于外界環(huán)境中時，對PH 和溫度的靈敏性很高，在常溫下若PH低于5.5或者高于9.5，就會導(dǎo)致豬瘟病毒滅活，而高溫下，56℃ 50min 或 60℃ 10min 就會被滅活。但是，CSFV具有冷穩(wěn)定性或在血液等基質(zhì)中可以存活較長的時間，在4℃下可以存活6 周以上，在-80℃下可以存活多年不被滅活，在血基質(zhì)中68℃ 30min依然具有感染性。常用的消毒劑可以迅速殺死CSFV，如2%氫氧化鈉溶液、乙醚、氯仿等。

2 病毒檢測方法的研究概況

2.1 病毒的分離

對于病毒感染進行診斷時，最好的方法是進行病毒分離。不過將病毒進行分離要花費很長時間進行觀察，還要把被感染的組織和血液等接種至對病毒相對敏感的細胞系上，培養(yǎng)并對細胞的變化進行仔細觀察，該方法需要高標準的操作環(huán)境和人員，因此多用于科研活動，在臨床樣本的快速診斷與檢測過程中，該方法并不適用。盡管病毒分離所需的條件相對較苛刻，但該方法是對于未知疾病進行診斷之中最可靠的方法。

對豬瘟病毒敏感的細胞系主要為PK-15以及SK-16細胞系。但是經(jīng)分離培養(yǎng)的CSFV的細胞病變，在顯微鏡下很難進行觀察，因而需要在觀察前對所觀察的細胞進行免疫熒光等方法染色。

豬繁殖與呼吸道綜合征病毒敏感的細胞系有Marck-145、MA-104等，而最敏感的細胞則應(yīng)該是豬肺泡巨噬細胞，因其是該病毒侵襲的首要目標，所以做豬繁殖與呼吸綜合征病病毒的分離也常使用該細胞。

豬偽狂犬病病毒較為敏感，即使在一般的細胞系上也能夠繼續(xù)繁殖，甚至能夠引起病變，不過在實驗室中常使用PK-15、BHK-21等細胞系來分離PRV，由于該病毒在一般的細胞系上都可增殖，所以要對分離的病毒進行確認，最直接的方法就是使用電鏡，并在電鏡下觀察到PRV病毒粒子。經(jīng)臨床檢測表明，臨床上常見的是多病聯(lián)合感染，通過上述方法將豬偽狂犬病毒分離的過程中容易出現(xiàn)假陽性，所以還應(yīng)和其他方法結(jié)合起來檢驗。

在2000年，我國從患有多系統(tǒng)衰竭綜合征病死豬的組織及血液中，首次對PCV2進行成功的分離。在實驗過程中，正常會利用PK-15細胞系將豬圓環(huán)病毒2型進行分離，不過經(jīng)過一系列的實驗后發(fā)現(xiàn)，在進行增殖分離時，并未出現(xiàn)細胞病變的現(xiàn)象，這在一定程度上表明還要和其他方法聯(lián)合起來，對其進行確認驗證。

2.2 血清學檢測技術(shù)

在抗體的常規(guī)檢測與診斷過程中，常使用血清學方法主要有病毒中和試驗，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），血凝血抑試驗以及免疫膠體金層析技術(shù)等。在進行病毒中和實驗時，其操作步驟和病毒分離增殖類似，都需要進行細胞培養(yǎng)，所以比較耗時費力。在臨床上ELISA、血凝血抑試驗使用較多，尤其是酶聯(lián)免疫檢驗試劑盒的存在，能夠使檢測變得更加便捷。比起前兩種方法，免疫膠體金層析技術(shù)更加快速便捷，是現(xiàn)如今相對較為新穎的檢驗手段。

若想要對豬瘟病毒進行血清學檢測，目前主要通過酶聯(lián)免疫方法進行檢驗。實驗者將豬瘟病毒E2蛋白和相應(yīng)的抗體當做基礎(chǔ)，進一步研究出直接和間接的酶聯(lián)免疫檢測手段，隨后，酶聯(lián)免疫吸附法被普遍應(yīng)用于豬瘟抗體水平的測定。不過上述方法在檢測豬瘟病毒抗體時，未表現(xiàn)出顯著的特異性，它會在一定程度上同其他瘟病毒的抗體相互反應(yīng)，導(dǎo)致得出的結(jié)果存在一定的偏差。

現(xiàn)如今，對于高致病性豬藍耳病的感染，過去有人將高致病性豬藍耳病病毒單克隆抗體探針作為基礎(chǔ)，進一步研究出了針對抗原的免疫層析檢測手段。該方法具有較高的靈敏度，并且它能夠檢測到的最低的病毒滴度為10-3TCID50/mL，該方法與常規(guī)PCR相比，在特異性和靈敏性方面不相上下，而速度卻高于常規(guī)PCR。

目前針對 PCV2的感染，ORF2基因編碼的Cap蛋白作為PCV2的保護性抗原，在臨床上常使用Cap蛋白用作包被抗原，并以此建立相應(yīng)的ELISA檢測方法，而后研究人員為驗證該方法的穩(wěn)定性和特異性，使用Cap蛋白當做包被抗原，進一步構(gòu)建酶聯(lián)免疫吸附法檢測手段，通過對156份豬血清進行檢測后，所得出的結(jié)果均表現(xiàn)良好。

因為現(xiàn)如今針對豬偽狂犬病進行預(yù)防接種的疫苗主要是g E基因缺失苗，所以可以通過檢測g E蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒，進一步把豬偽狂犬病疫苗毒以及非疫苗毒進行區(qū)分。有關(guān)研究人員以豬偽狂犬病病毒抗體作為基礎(chǔ)，進一步構(gòu)建了磁性電化學免疫檢測手段，它能夠根據(jù)電極檢測表，進一步對由電化學活性物質(zhì)標記的抗原抗體復(fù)合物的電信號進行檢測，從而得出相應(yīng)的結(jié)果。即使該方法的操作相對簡便，不過該方法還需進一步完善，目前還不能夠被推廣沿用。

2.3 分子生物學檢測技術(shù)

由于目前的分子生物學技術(shù)的不斷成熟，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)已廣泛被應(yīng)用在臨床診斷以及疾病檢測中，和病毒分離或血清學檢查等方法比起來，PCR具有花費時間短、結(jié)果可靠性強、靈敏度高以及步驟簡便等優(yōu)點。PCR技術(shù)通過變性-退火-延伸3個基本反應(yīng)階段實現(xiàn)了DNA序列的體外擴增。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學領(lǐng)域的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)。實時熒光定量PCR（qPCR）通過熒光染料或熒光標記的具有特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，可以實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，通過繪制標準曲線，計算待測樣品模板的初始濃度，從而實現(xiàn)較為簡便的定量檢測。除此之外，等溫核酸擴增技術(shù)在近十幾年的時間里不斷出現(xiàn)，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（LAMP），該方法主要是在大約60℃下進行的，操作過程不繁瑣，對設(shè)備無過高要求（水浴鍋即可完成），所以在該方法問世至今，已經(jīng)被廣泛使用在病原體的檢驗。LAMP方法缺點主要在反應(yīng)過程中一旦開蓋就容易產(chǎn)生氣溶膠污染，導(dǎo)致假陽性問題比較嚴重。近年國內(nèi)出現(xiàn)了一種重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)（Recombinase Aided Amplification），簡稱RAA，該技術(shù)利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶在等溫（39℃）條件下進行核酸擴增，結(jié)合熒光即時檢測，實現(xiàn)5～20min輸出結(jié)果，靈敏度達到10copies/測試，該方法對環(huán)境溫度、操作技能和實驗設(shè)備要求更低，具有很大發(fā)展優(yōu)勢。不過上述方法最主要的問題是引物的設(shè)計方面要求比較高，有些疾病的基因可能不適合某些方法。最近，在對基因進行檢測時，漸漸傾向于向微量和高通量的方向發(fā)展，其主要代表便是基因芯片技術(shù)。該方法巧妙地把現(xiàn)代分子生物學同微電子科學相聯(lián)系，對于疾病的監(jiān)測以及基因檢測等多個領(lǐng)域具有很大的發(fā)展?jié)撃堋?/p>