林萬(wàn)華,劉 翠,張 文,林 昊,王珍珍
(1.廣東容大生物股份有限公司 511517;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 510640;3.清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司 511517)
七清敗毒顆粒是中獸藥經(jīng)典處方,由黃芩、虎杖、白頭翁、苦參、板藍(lán)根、綿馬貫眾、大青葉七味中藥材組成,具有清熱解毒,燥濕止瀉的功效[1-2],對(duì)畜禽多種細(xì)菌、病毒性疾病具有較好的防治效果,如白痢、感冒、傳染性支氣管炎等。本中藥配伍中黃芩和虎杖的象征成分為黃芩苷和虎杖苷;因此,鑒定黃芩苷和虎杖苷成分作為七清敗毒顆粒顆粒質(zhì)量判定依據(jù)?!吨袊?guó)獸藥典》2015版二部對(duì)七清敗毒顆粒質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)是采用薄層色譜法,分別檢測(cè)其中是否含有黃芩苷、虎杖苷等成分[1][3],此鑒別方法較繁瑣,并未對(duì)黃芩苷和虎杖苷做含量測(cè)定。為科學(xué)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)七清敗毒顆粒質(zhì)量,本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)七清敗毒顆粒中黃芩苷和虎杖苷含量同時(shí)測(cè)定的方法進(jìn)行了研究。
日本島津LC-20A高效液相色譜儀;超純水儀UPK-5T;超聲波儀;梅特勒—托利多天平MS105DU;黃芩苷對(duì)照品:Z0271109,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;虎杖苷對(duì)照品:111575-201603,中國(guó)食品藥品檢定研究院;樣品:七清敗毒顆粒2012003,廣東容大生物股份有限公司;試劑:甲醇、乙腈、磷酸為色譜純,水為分析用純水。
流動(dòng)相:乙腈-水-磷酸(25∶75∶0.1),色譜柱:島津C18 5u 4.6×250mm,檢測(cè)波長(zhǎng):315nm,流速:1.0mL/min,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:20μL
2.2.1 稀釋液:甲醇
2.2.2 黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱取黃芩苷對(duì)照品10.0mg,置25mL棕色量瓶中,加甲醇使溶解并定容至刻度,搖勻,作為黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。
2.2.3 虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱取虎杖苷對(duì)照品10.0mg,置25mL棕色量瓶中,加甲醇使溶解并定容至刻度,搖勻,作為虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。
2.2.4 混合對(duì)照品溶液:取上述1.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0mL及1.3.3項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL到50mL容量瓶中,加稀釋液定容,搖勻,制成含黃芩苷40μg/mL、虎杖苷8μg/mL的混合對(duì)照品溶液。
取七清敗毒顆粒適量,研細(xì),置100mL棕色量瓶中,加甲醇40mL,超聲處理(功率500W,頻率40kHz)30min,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
2.4.1 黃芩苷、虎杖苷系統(tǒng)適用性
取上述1.3.4項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液20μL按1. 2色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定并計(jì)算柱效、分離度和拖尾因子(具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1)。
表1 黃芩苷、虎杖苷系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
2.5.1 黃芩苷、虎杖苷線性實(shí)驗(yàn)
取上述1.3.2項(xiàng)黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液及1.3.3虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋成含黃芩苷5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL、100.00μg/mL,虎 杖 苷1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、20.00μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液,按1.2色譜條件測(cè)定,以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性比較,黃芩苷峰面積的回歸方程為:Y=54836X-115539(R2=0.9997),說(shuō)明黃芩苷在5~100μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(具體見(jiàn)圖1),虎杖苷峰面積的回歸方程為:Y=109836X-11176(R2=0.9999),說(shuō)明虎杖苷在1~20μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(具體見(jiàn)圖2)。
圖1 黃芩苷線性范圍數(shù)據(jù)圖
圖2 虎杖苷線性范圍數(shù)據(jù)圖
2.5.2 黃芩苷、虎杖苷測(cè)定線性色譜圖
圖3 黃芩苷、虎杖苷測(cè)定線性液相色譜圖
2.6.1 黃芩苷、虎杖苷重復(fù)性試驗(yàn)
精密吸取1.3.4混合對(duì)照品溶液適量,按1. 2項(xiàng)色譜條件測(cè)定,進(jìn)樣5次,獲得黃芩苷峰面積的RSD為0.1%,虎杖苷峰面積的RSD為0.09%,表明該色譜條件對(duì)黃芩苷和虎杖苷檢測(cè)的重復(fù)性良好。具體見(jiàn)表2。
表2 黃芩苷進(jìn)樣重復(fù)性數(shù)據(jù)
2.7.1 黃芩苷、虎杖苷回收率試驗(yàn)
精密取已知黃芩苷含量(6.5mg/mL)、虎杖苷含量(0.78mg/mL)的同一批樣品約0.50g(共9份)置于100mL容量瓶中,分別加入上述1.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0mL、5.0mL、6.0mL及1.3.3項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8mL、1.0mL、1.2mL,按上述1.4項(xiàng)要求處理,進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定并計(jì)算黃芩苷的平均回收率為99.9% ,虎杖苷的平均回收率為100.06%。具體見(jiàn)表3、表4。
表3 黃芩苷回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)
表4 虎杖苷回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)
取上述1.3.4項(xiàng)下的黃芩苷、虎杖苷混合對(duì)照品溶液,按1.2色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得黃芩苷、虎杖苷混合對(duì)照品色譜圖譜如下(圖4)。
圖4 黃芩苷、虎杖苷液相色譜圖
取3批七清敗毒顆粒樣品及對(duì)照品溶液,按外標(biāo)法測(cè)定,每批樣品進(jìn)樣2次,計(jì)算樣品中黃芩苷、虎杖苷含量(圖譜見(jiàn)圖5)。3批七清敗毒顆粒樣品的含量測(cè)定結(jié)果分別為黃芩苷6.51mg/g、6.50mg/g、6.51mg/g,虎杖苷0.78 mg/g、0.78mg/g、0.79mg/g。
圖5 七清敗毒顆粒樣品的液相色譜圖
3.1黃芩藥材中的黃芩苷含量測(cè)定液相條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(C18色譜柱),以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;虎杖藥材中虎杖苷含量測(cè)定液相條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水(23∶77)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm[1]。黃芩苷在波長(zhǎng)為280nm、316nm處有最大吸收,虎杖苷在217nm、306nm、314nm處有最大吸收。從藥典中可以明確,黃芩苷的含量測(cè)定采用280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),而虎杖苷則選擇了306nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本方法參考了藥典檢測(cè)條件,選擇了315nm波長(zhǎng)兼顧兩個(gè)被測(cè)成分在314nm~316nm中有最大吸收,以保證檢測(cè)的最大靈敏度。
3.2 在流動(dòng)相確立方面,參考了中國(guó)獸藥典黃芩苷、虎杖苷檢測(cè)的色譜條件,結(jié)合侯麗麗[2]、黃良永[5]等方法研究結(jié)果,確立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定七清敗毒顆粒中黃芩苷、虎杖苷含量的方法:乙腈—水—磷酸(25∶75∶0.1),色譜柱:島津C18 5u 4.6×250mm,檢測(cè)波長(zhǎng):315nm,流速:1.0mL/min,柱溫:30℃,進(jìn)樣量:20μL;其中在流動(dòng)相中增加0.1%的磷酸,起到適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH改變色譜峰型作用。
3.3為避免黃芩苷與虎杖苷兩個(gè)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)值相互影響,特做了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度檢測(cè)嘗試,最終確立黃芩苷在濃度為 5~100μg/mL,虎杖苷在濃度為 1~20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢測(cè)峰相應(yīng)值大小相當(dāng),積分條件統(tǒng)一。該方法具有線性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),為其質(zhì)量判定提供了更科學(xué)的依據(jù)。