張繼云,王梅,趙旌,李文艷

新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(新疆烏魯木齊 830000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatiod arthritis，RA)是一種以持續(xù)性滑膜炎癥為特征的異質(zhì)性慢性自身免疫性疾病，病因不明，可能由感染和組織損傷等未知起始事件引起，各種炎性細(xì)胞因子造成關(guān)節(jié)疼痛腫脹及系統(tǒng)損害等炎癥過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨和骨質(zhì)破壞[1]。目前已經(jīng)證實(shí)輔助性 T 細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞在RA中起關(guān)鍵性作用，屬于CD4+T 細(xì)胞的一類亞群，因其分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17)，所以被稱之為 Th17細(xì)胞[2]。信號(hào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導(dǎo)因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)與轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體C(retinoic acid-related orphan receptor C，RORC)是Th17細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)經(jīng)典的JAK/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路活化，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[3]，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜增殖、軟骨侵蝕和全身性的炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)RA的發(fā)病[4-5]。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-38是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，隸屬于IL-1家族(IL-1 family，IL-1F)，在2001年被命名為IL-1HY2[6]。IL-38在多種組織中表達(dá)，如心臟、胎盤、嬰兒肝臟、皮膚、脾臟、胸腺以及扁桃體上增殖的B細(xì)胞中表達(dá)。最近的研究表明，IL-38與慢性炎癥性疾病，特別是風(fēng)濕免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)[7-8]、RA[9-10]、銀屑病[9,11]和炎性腸病(IBD)有密切的聯(lián)系[9]。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，在RA患者體內(nèi)IL-38通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，參與了RA的發(fā)生、發(fā)展[12]。但其具體機(jī)制尚不清楚，在本研究中，通過(guò)觀察RA患者IL-38對(duì)Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的影響，從而深入探討IL-38在RA發(fā)病機(jī)制中的作用，評(píng)估IL-38作為RA臨床生物標(biāo)志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2016年1—4月RA患者30例，年齡28～58歲，平均(34.2±9.6)歲，其中女19例，男11例，診斷均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；30例新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心的健康人群作為正常對(duì)照組，年齡30～60歲，平均(36±8.5)歲，其中女20例，男10例，均無(wú)風(fēng)濕病史和風(fēng)濕病家族史。兩組間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者知情同意后，獲取血液標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monocytes，PBMCs)分離、培養(yǎng) 采集肝素抗凝外周血5 mL，3 000 r/min，離心10 min，吸取上層血清，-80℃凍存，待ELISA檢測(cè)；向淋巴細(xì)胞分離液中加入2倍稀釋的血漿分離PBMCs計(jì)數(shù)，向5×105PBMCs中加人0.5 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置24孔板中培養(yǎng)，加入5 μg/mL PHA，其中一組中加入50 ng/mL人重組IL-38，置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)72 h。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 將血漿標(biāo)本從-80℃冰箱取出，室溫下融化，將試劑盒從冷藏室拿出，室溫放置15 min。采用IL-38檢測(cè)試劑盒、RT-6100酶標(biāo)分析儀，嚴(yán)格按照試劑盒及儀器操作說(shuō)明對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) Trizol法抽提總RNA，用含反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTMRTase逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-70℃保存。在ABI Prism 7500測(cè)序儀上以cDNA為模版利用DNA聚合酶TaKaRa EX TapTMHS進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體操作參照SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以SDS2.0(PE Biosystem)軟件分析各孔Ct值(模板拷貝數(shù)擴(kuò)增到指數(shù)上升期所需反應(yīng)循環(huán)數(shù)大小,Ct值越大,拷貝數(shù)越少)。以GAPDH作為內(nèi)參，將Ct值減去GAPDH Ct值作為ΔCt值。ΔCt值越低，則表達(dá)水平越高。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后2-ΔΔCt值表示mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RA組和正常對(duì)照組IL-38表達(dá)水平的比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示RA患者IL-38基因表達(dá)水平(2.92±1.96)顯著低于正常對(duì)照組(5.79±3.55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.28，P<0.05)；RA患者IL-38蛋白表達(dá)水平(0.44±0.03)顯著低于正常對(duì)照組(0.72±0.58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.59，P<0.05)；

2.2 RA組和正常對(duì)照組RORC mRNA表達(dá)水平的比較 RA患者RORC mRNA(6.29±3.98)顯著高于正常對(duì)照組(1.6±0.95)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.36,P<0.05)；且RORC mRNA表達(dá)水平與IL-38水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.31，P<0.05)。

2.3 RA組和正常對(duì)照組STAT3 mRNA表達(dá)水平的比較 RA患者STAT3 mRNA(2.72±2.11)顯著高于正常對(duì)照組(0.69±0.67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.24,P<0.05)；且STAT3 mRNA表達(dá)水平與IL-38水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.25，P<0.05)；

2.4 IL-38對(duì)轉(zhuǎn)錄因子STAT3表達(dá)水平的影響 在體外實(shí)驗(yàn)中，RA患者外周血中加入IL-38后，RORC基因表達(dá)水平(1.87±1.59)較RA患者(6.29±3.98)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.48,P<0.05)。

2.5 IL-38對(duì)轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA表達(dá)水平的影響 在體外實(shí)驗(yàn)中，RA患者外周血中加入IL-38后，STAT3基因表達(dá)水平(0.58±0.13)較RA患者(2.72±2.11)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.37,P<0.05)。

3 討論

RA是一種以與炎癥環(huán)境相聯(lián)系的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎癥和破壞為特征的自身免疫性疾病[13]。疾病的發(fā)展伴隨著滑膜細(xì)胞增生、新生血管形成，以及局部大量T細(xì)胞浸潤(rùn)。如果不經(jīng)過(guò)正規(guī)治療，病情會(huì)逐漸發(fā)展，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，具有很高的致殘率。據(jù)報(bào)道IL-38基因多態(tài)性與脊柱炎、RA和銀屑病性關(guān)節(jié)炎易感性相關(guān)[14-16]。此外，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)IL-38的過(guò)度表達(dá)或敲除參與了自身免疫性疾病的發(fā)病[8,17-18]。由于炎性細(xì)胞因子與慢性炎癥性疾病在多個(gè)層面上具有緊密的聯(lián)系，結(jié)合最近IL-38相關(guān)性的研究結(jié)果，使得IL-38在炎癥性疾病中的調(diào)節(jié)能力而受到關(guān)注。

本研究通過(guò)比較RA患者和對(duì)照組外周血IL-38水平，我們發(fā)現(xiàn)RA患者IL-38表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，基于目前的多項(xiàng)研究報(bào)道IL-38是一種抗炎因子，可能是經(jīng)由自分泌或旁分泌通路釋放發(fā)揮免疫抑制作用，說(shuō)明在RA患者體內(nèi)IL-38分泌減少，不能發(fā)揮與受體結(jié)合以及調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的生成作用，從而參與了機(jī)體RA的發(fā)生、發(fā)展。我們前期報(bào)道了RA患者IL-38表達(dá)水平與Th17細(xì)胞數(shù)量及IL-17濃度均呈負(fù)相關(guān)，且IL-38能夠抑制Th17細(xì)胞的增殖[12]。為進(jìn)一步明確IL-38對(duì)RA患者Th17細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，我們檢測(cè)RA患者組和健康對(duì)照組Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC、STAT3表達(dá)水平，結(jié)果顯示RA患者RORC、STAT3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，并且分別與IL-38水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明IL-38與RORC、STAT3具有一定的相關(guān)性。在體外實(shí)驗(yàn)中，將IL-38加入RA患者外周血中，發(fā)現(xiàn)外周血中RORC、STAT3 mRNA表達(dá)水平較前下降，提示IL-38能夠抑制RORC、STAT3的表達(dá)，綜合以上結(jié)果，我們推測(cè)IL-38通過(guò)抑制Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC、STAT3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而降低了Th17細(xì)胞的活化，導(dǎo)致了RA的發(fā)病。

IL-38首次被發(fā)現(xiàn)距今已經(jīng)17年，但是目前對(duì)于IL-38的認(rèn)識(shí)仍然很少。IL-38屬于IL-1F，大部分IL-1F亞家族被認(rèn)為是炎性細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)炎癥性疾病相關(guān)基因的表達(dá)。通過(guò)我們以上的研究發(fā)現(xiàn)，IL-38能夠通過(guò)調(diào)控Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC、STAT3的表達(dá)，造成Th17細(xì)胞的分化成熟障礙，最終通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子的分泌達(dá)到抑制炎癥的作用。因此，對(duì)IL-38的研究將有助于在治療RA疾病中發(fā)掘新靶點(diǎn)。