石磊泰,李玉華

狂犬病病毒是彈狀病毒家族的單鏈RNA病毒,可以感染多種哺乳動物,大約95%的人類感染是由狗咬傷引起的,其他宿主包括土狼、臭鼬和蝙蝠等[1]。由于病例報告不足和缺乏可靠的監(jiān)測數(shù)據(jù),狂犬病的真正感染狀況難以量化[2],但據(jù)目前估計,有超過30億人處于較高感染風險,每年有約60 000人患病死亡,大約每10 min就有1人死亡[3]。

慶幸的是,路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)早在1885年就發(fā)明了狂犬病疫苗[4-5]。盡管長期以來一直存在有效的狂犬病疫苗,但在一些發(fā)展中國家疫苗的可用性仍然不足,致命的感染數(shù)量很高。

令人振奮的是,基于核酸的疫苗技術已被證明是用于快速開發(fā)針對新興病原體、無疫苗疾病或用于替代現(xiàn)有疫苗的新技術。目前文獻最早關于m RNA疫苗的報道發(fā)表于1990年,當時Wolff將報告基因mRNA注射到小鼠體內后檢測到相關蛋白質的產生[6]。1992年的一項后續(xù)研究表明,在大鼠下丘腦注射編碼加壓素的m RNA可以引起生理反應[7]。

與亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒活疫苗以及DNA疫苗相比,m RNA疫苗有其獨特的優(yōu)勢[8-12]。安全性方面:m RNA是一個非感染性、非整合性平臺,不存在感染或插入突變的潛在風險。m RNA可被正常的細胞代謝降解,其半衰期可以通過各種修飾和傳遞方法來調節(jié)。mRNA的固有免疫原性可被下調以進一步提高安全性。有效性方面:多種修飾使m RNA更穩(wěn)定,更易翻譯。有效的體內傳遞可以通過將m RNA形成載體分子來實現(xiàn),允許其在細胞質中被快速攝取和表達。規(guī)模化生產:由于體外轉錄反應的高產量,m RNA疫苗具有快速、低成本和大規(guī)模生產的潛力。

目前各類m RNA疫苗在基礎研究和臨床研究方面都出現(xiàn)了突破性進展,本文僅對m RNA疫苗在狂犬病方面的應用和研究做一綜述。

1 mRNA疫苗的結構

目前應用于狂犬病m RNA疫苗的研究策略主要有兩種,一種是非復制型mRNA疫苗(non-replicating m RNA),另一種是自擴增型m RNA疫苗(self-amplifying mRNA,SAM)。

1.1 非復制型m RNA 非復制m RNA的組成包括:5′帽子、3′poly A尾、非翻譯區(qū)(UTR)和編碼序列。

5′帽子結構是在體外轉錄過程中加入核苷酸的5′端。最常見的帽子結構是7-甲基鳥苷三磷酸(m7G)cap(cap0),它能阻止m RNA的早期降解,在m RNA的成熟、轉運和初始翻譯過程中起著關鍵作用[13]。但加帽會出現(xiàn)序列方向反轉,導致沒有形成帽子結構而無法正常轉錄[14]。為避免這類錯誤發(fā)生,在帽子結構鳥苷的3′-O位上進行甲基化,使其只有一個3′-OH可以添加核苷酸,形成防反帽子結構,從而大幅提高m RNA的表達[15]。

3′Poly A尾通過與多聚腺苷酸結合蛋白、起始轉錄因子和5′帽子形成復合物來發(fā)揮作用[16]。研究表明增加Poly A尾的長度提高蛋白表達效率[17],但Poly A的最佳長度為100～150個核苷酸[18-19]。

非翻譯區(qū)UTR是影響mRNA轉運與翻譯效率、細胞器定位和穩(wěn)定m RNA結構的重要元件。目前被廣泛應用的UTR為α-和β-球蛋白基因序列,它們能夠大幅提高RNA的轉錄效率和穩(wěn)定性[20-23]。此外,人熱休克蛋白70、煙草蝕紋病毒、內部核糖體進入位點等序列也被應用于UTR以提高轉錄效率[24-26]。

有文獻報道,提高序列中C、G的比例、對堿基進行編輯優(yōu)化,可以提高mRNA穩(wěn)定性[27]。對m RNA的核苷酸進行甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、硫代尿嘧啶等化學修飾可以降低固有免疫反應[28-29]避免m RNA疫苗遭到固有免疫清除而影響免疫效果。但也有研究表明,堿基和核苷酸的改變可能導致m RNA二級結構改變,可能會影響蛋白正確折疊和T細胞表位暴露,反而降低了免疫效果[30-32]。

1.2 自擴增型m RNA疫苗 自擴增型的m RNA比非擴增型mRNA要大得多(9～10 kb),但也含有m RNA的基本成分(一個帽子,5′UTR,3′UTR和可變長度的poly A尾)[33]。自擴增型m RNA包含5′帽子、非結構基因(nsP1-4)、26S亞基因組啟動子、疫苗抗原基因、3′非翻譯區(qū)(UTR)和poly A尾。研究最深入的自擴增型mRNA來自甲病毒基因組,例如辛德比斯、塞姆利基森林和委內瑞拉馬腦炎病毒。在以甲病毒為基礎的自擴增型m RNA中,額外的RNA包含一個大的開放讀碼框(ORF)、四個非結構蛋白編碼區(qū)(nsP1-4)和一個亞基因組啟動子。病毒基因組中編碼病毒結構蛋白的基因被目的基因所取代,從而使得mRNA不能產生感染性病毒。釋放的m RNA進入細胞漿后具有翻譯活性,與宿主細胞核糖體結合產生RNA依賴性RNA聚合酶(RDRP)或病毒基因組復制的4種功能成分:nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。翻譯后的nsPs在細胞膜表面形成復制工廠,從輸入m RNA轉錄全長負鏈拷貝。該負鏈拷貝作為兩個正鏈RNA分子的模板:基因組m RNA和較短的共線亞基因組m RNA。該亞基因組mRNA(也稱為26S RNA)以極高的水平轉錄,從而可以擴增編碼疫苗抗原的m RNA。

2 遞送系統(tǒng)

外源mRNA必須穿過脂膜屏障才能到達細胞質轉化為功能蛋白,迄今為止有兩大類m RNA疫苗的遞送方法[34]。第一大類,體外將mRNA導入樹突狀細胞(DC),然后再輸注轉染細胞;第二大類,直接注射有或沒有載體的mRNA。第1種可以精確控制細胞靶點、轉染效率和其他細胞條件,主要用于細胞治療。第2種直接注射mRNA方法雖然還不能實現(xiàn)精確和有效的細胞類型特異性傳遞,但是一種相對快速和經濟有效的方法。以下介紹mRNA疫苗的幾種遞送系統(tǒng)。

2.1 樹突狀細胞(DC) 樹突狀細胞是免疫系統(tǒng)中最有效的抗原呈遞細胞。它們通過內化和蛋白質水解處理抗原并將其呈遞給主要組織相容性復合體(MHC)上的CD8＋和CD4＋T細胞(即MHCⅠ類和MHCⅡ類)啟動適應性免疫應答。此外,樹突狀細胞可將完整抗原呈遞給B細胞以激發(fā)抗體反應[35]。樹突狀細胞很容易接受mRNA轉染,因此樹突狀細胞是m RNA疫苗在體內和體外轉染非常有效的途徑。這種m RNA傳遞方法因其不需要載體分子就能產生高轉染效率而受到青睞[36]。

2.2 裸m RNA 裸m RNA已成功應用于體內免疫,特別是優(yōu)先靶向抗原提呈細胞的形式,如皮內注射、鼻內注射[37]。值得注意的是,最近的一份報告顯示,用編碼腫瘤相關新抗原的未修飾的m RNA重復在鼻內免疫可產生強大的T細胞應答,并增加半衰期[38]。

2.3 魚精蛋白 陽離子肽魚精蛋白可以保護m RNA不被血清RNA酶降解[39],起到免疫激活劑的作用[40],然而魚精蛋白和m RNA過度緊密結合可能影響m RNA的表達[41]。

2.4 陽離子脂質 脂質納米顆粒(LNPs)早期應用于小干擾RNA(siRNA)領域[42],直到最近才發(fā)現(xiàn)LNPs是體內傳遞非復制m RNA[43]和自擴增型m RNA的有效工具[44],目前已成為最具吸引力和最常用的信使RNA傳遞工具之一。LNPs通常由4個部分組成:一種可電離的陽離子脂質,可促進自組裝成病毒大小的顆粒,并允許向細胞質釋放m RNA;脂聯(lián)聚乙二醇(PEG),可以延長制劑的半衰期;膽固醇,起穩(wěn)定制劑作用;磷脂,維持脂質雙層結構。

2.5 陽離子納米乳劑(CNE) 陽離子納米乳劑(CNE)遞送系統(tǒng),用于遞送自擴增型m RNA疫苗。這種遞送系統(tǒng)基于諾華公司專有的佐劑MF59添加了陽離子脂類(2-二油?；u丙基-3-N,N,N-三甲銨氯,DOTAP)制成。有研究表明,在小鼠、大鼠、兔子和非人類靈長類動物中,CNE遞送一個9 kb大的自擴增型m RNA可引發(fā)強大的免疫應答[45]。

3 非復制型mRNA疫苗的應用研究

3.1 臨床前研究 Schnee等[46]2016年使用優(yōu)化的非復制型狂犬病毒糖蛋白RABV-G(巴斯德株,GenBank登錄號:AAA47218.1)編碼的mRNA疫苗用小鼠和家豬測試免疫反應,他們將構建的RABV-G m RNA疫苗命名為CV7201。CV7201是利用巴斯德狂犬病毒株的糖蛋白基于RNA技術平臺所構建,用脂質納米粒包裹后加魚精蛋白作為穩(wěn)定劑制成。雌性C57BL/6和BALB/c小鼠在第0 d和第21 d皮內注射接種CV7201疫苗,注射劑量為1.25μg到80μg。第2次 免 疫 后2周,100%的C57BL/6小鼠和90%(29/32)的BALB/c小鼠注射了≥10μg CV7201疫苗,均產生≥0.5 IU/m L的病毒中和抗體滴度[47]。在這兩種品系的小鼠中均觀察到劑量-反應關系,并且在劑量≥10μg時誘導產生高中和抗體滴度。在免疫耐久性方面,BALB/c小鼠在第0 d和第21 d接種兩次疫苗,觀察4個不同劑量1.25μg、5μg、20μg、80μg CV7201疫苗免疫小鼠1年左右,每月檢測小鼠血清抗體,所有用CV7201疫苗免疫的小鼠都產生了高滴度的中和抗體。研究發(fā)現(xiàn)接種20μg和80μg CV7201后,抗體滴度在整個觀察期內保持穩(wěn)定,平均滴度在17和65 IU/m L之間。對于1.25μg和5μg疫苗劑量,免疫反應在觀察期剛開始出現(xiàn)延遲,但在實驗第12周趕上,抗體滴度保持在≥10 IU/m L的高水平,所有試驗組的個體間變異性較低。

雖然T細胞不能阻止宿主細胞的初始病毒感染,但它們對小鼠體內狂犬病病毒的清除有重要影響[48]。Schnee M同時也開展了針對CV7201細胞免疫方面的研究,結果顯示:在第2次接種80μg CV7201或0.1人劑量Rabipur后6 d,在所有接種小鼠中檢測到抗原特異性干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)CD8

＋和CD4＋T細胞出現(xiàn)增高的現(xiàn)象。接種Rabipur或CV7201疫苗的小鼠RABV-G特異性CD8＋T細胞的增高具有可比性(例 如IFN-γ/TNF-α雙 陽 性CD8＋T細胞,接種CV7201后平均值為0.59%,接種Rabipur后平均為0.43%)。相反,與高比例IFN-γ/TNF-α雙陽性CD4＋T細胞的Rabipur免疫小鼠相比,m RNA免疫小鼠的抗原特異性CD4＋T細胞顯著升高(RABV-G m RNA免疫小鼠表達IFN-γ/TNF-α的CD4＋T細胞的平均值為0.48%,而Rabipur的平均值為0.091%)。

用狂犬病毒對實驗動物進行腦內病毒攻擊雖然是一個人為的、極其嚴峻的挑戰(zhàn),但被科學界認為是一個嚴格的、有說服力的測試實驗。Schnee M利用NIH法[49]對BALB/c小鼠在第0 d和第21 d接種80μg CV7201。陽性對照小鼠肌肉接種0.1人劑量的二倍體狂犬病疫苗,陰性對照小鼠接種注射緩沖液(乳酸林格溶液)。第2次注射6周后,用40個LD50的CVS-11進行腦內攻毒,結果顯示:所有CV7201和二倍體狂犬病疫苗免疫小鼠均能抵抗狂犬病毒的攻擊。這項攻擊性研究清楚地表明CV7201疫苗能誘導對致命感染的保護性免疫。

Schnee M進一步評價了CV7201疫苗在家豬體內的免疫原性。在成年豬中,抗體水平在第一次免疫后達到≥0.5 IU/m L的保護水平,并且可以通過加強免疫進一步增加,抗體水平在整個試驗期間保持穩(wěn)定。有趣的是,第三次疫苗接種并沒有導致抗體水平進一步增加。另外,針對新生豬仔的免疫研究也顯示加強免疫可以使豬仔體內抗體水平進一步提高。

Schnee M的這項研究證明了非復制性m RNA狂犬病疫苗在小型和大型動物中的可行性,并展示了m RNA疫苗在預防傳染病方面的前景。

3.2 臨床研究 基于編碼抗原的m RNA的疫苗在臨床前模型中被證明了其安全性和有效性[46]。Alberer M等[50]2017年報告了狂犬病m RNA疫苗CV7201在健康人體的研究結果,這是世界上第一次把狂犬病m RNA疫苗應用于人體臨床研究的報道(臨床批件為NCT02241135)。

2013年10月21日至2016年1月11日,在德國慕尼黑開展了這項開放性、非對照、前瞻性的1期臨床試驗,入圍人群是101名無狂犬病疫苗接種史的健康男性和女性志愿者(年齡18～40歲)。志愿者分皮下和肌肉注射兩種免疫途徑分別接種3劑CV7201,接種裝置為帶針頭注射器和三種無針注射器(彈簧式皮內注射器、二氧化碳氣動皮內注射器和彈簧式肌肉注射器)。帶針注射器肌肉免疫組共4個隊列,每隊列6人,免疫劑量分別為80、160、320和640μg,免疫程序均為0、28和56 d;彈簧式肌肉注射器肌肉免疫組共2個隊列,7人隊列接種200 μg,6人隊列接種400μg,免疫程序均為0、28和56 d。帶針注射器皮下免疫組共3個隊列,2個6人隊列分別接種80、160μg,免疫程序均為0、7和28 d,第3個6人隊列接種320μg,免疫程序為0、28和56 d;彈簧式皮內注射器皮下免疫組共3個隊列,兩個6人隊列分別接種80、160μg,免疫程序為0、28和56 d,第3個6人隊列接種80μg,免疫程序為0、7和28 d。二氧化碳氣動皮內注射器皮下免疫組共2個隊列,6人隊列接種80μg,7人隊列接種160 μg,免疫程序均為0、7和28 d。對隨后的隊列給予遞增劑量,其中一個隊列在1年后接受增強劑量。

這項研究的主要終點是安全性和耐受性,次要終點是確定CV7201的最低劑量以誘導狂犬病病毒中和抗體水平等于或大于WHO規(guī)定的保護性抗體水平0.5 IU/m L。在接種后的7 d內,64名皮內接種受試者中有60名(94%)和37名肌肉接種受試者中有36名(97%)報告了注射部位不良反應,64名皮內接種受試者中有50名(78%)和37名肌肉接種受試者中有29名(78%)報告了全身不良事件。有3個嚴重不良事件,其中一個被研究者評估為可能與研究疫苗接種有關。報告1例暫時性中度(2級)貝爾麻痹,在第二次注射640μg CV7201后7 d,出現(xiàn)疑似意外的嚴重不良反應。

不考慮免疫劑量和免疫程序的情況下,使用無針注射裝置接種m RNA疫苗,皮內注射80μg或160μg CV7201劑 量 的45名 受 試 者 中 有32名(71%)以及肌肉注射200μg或400μg CV7201劑量的13名受試者中有6名(46%)受試者的病毒中和抗體滴度在0.5 IU/m L或以上。相反,用帶針注射器進行皮內或肌肉免疫效果不佳,只有2名志愿者(皮內注射320μg)顯示出可檢測的免疫反應。

這項首次在健康人群開展的臨床研究結果表明,一種預防性m RNA候選狂犬病疫苗盡管在使用帶針注射器免疫時不能產生有效的免疫反應,但在使用無針裝置免疫時卻可以誘導產生針對病毒抗原的功能性抗體。疫苗總體上是安全的,也具有合理的耐受性,但是不良反應也不容忽視[51]。

4 自擴增型mRNA疫苗的應用研究

Alan Stokes等[52]2020年報道了一種新型狂犬病自擴增型m RNA疫苗(RG SAM)在大鼠身上重復給藥及生物分布的非臨床安全性評價性研究。該技術平臺由編碼RNA依賴性RNA聚合酶的工程復制缺陷型甲病毒基因組和目標抗原基因組成。該研究采用狂犬病毒糖蛋白G作為目標抗原并選擇陽離子納米乳劑(CNE)作為遞送系統(tǒng)。為了描述這種疫苗的局部耐受性、潛在的全身毒性和生物分布,研究人員開展了兩項非臨床研究。

在重復劑量毒性研究中,對大鼠進行肌肉注射RG SAM疫苗,每兩周注射一次,共4次,留四周的恢復期。大鼠免疫RG SAM疫苗后的相關變化包括中性粒細胞、α-2巨球蛋白和纖維蛋白原水平的短暫增加,雌性大鼠體內出現(xiàn)天冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶一過性的升高?；铙w解剖時可以觀察到局部淋巴結有炎癥浸潤,但在恢復期炎癥自行消失,淋巴結也恢復正常。

在生物分布研究中,大鼠單次肌肉注射RG SAM疫苗后觀察60 d。第2 d在注射部位和淋巴結中發(fā)現(xiàn)狂犬病毒RNA,隨著觀察期延長這些組織中的狂犬病毒RNA分布逐漸減少,到第60 d時仍然可以檢測到?？袢《綬NA也會在大鼠的血液、肺、脾和肝中短暫出現(xiàn),但在大鼠的腦和脊髓中沒有觀察到微觀的病理變化。

Alan Stokes的這項研究對狂犬病自擴增型m RNA疫苗進行了初步探索,雖然未對疫苗的安全性和有效性展開深入探討,但也為后續(xù)自擴增型m RNA疫苗技術的完善提供了實驗數(shù)據(jù)。

5 結 語

m RNA疫苗的興起已成為傳統(tǒng)疫苗最有希望的替代方法,m RNA疫苗因其適宜大規(guī)模生產和低成本等優(yōu)點備受科學界青睞,并且在癌癥治療和疾病預防方面取得階段性進展。雖然狂犬病m RNA疫苗也有進入臨床試驗的報道,但試驗結果并不盡如人意。研究者還需從根本上解決注射狂犬病m RNA疫苗后引起的嚴重不良反應,如面癱。解決這一問題也許需要從RNA構建平臺入手,也許需從遞送系統(tǒng)考慮。狂犬病是致死性疾病,不能在所有接種者中實現(xiàn)足夠安全和有效的狂犬病疫苗是不可接受的。

近期,國內有研發(fā)機構發(fā)明了以狂犬病毒CTN-1株糖蛋白為模板構建的m RNA人用狂犬病疫苗[53],但目前尚未看到后續(xù)的進展報道。希望國內的疫苗企業(yè)在狂犬病m RNA疫苗研發(fā)方面也能取得突破性進展。

利益沖突:無

引用本文格式:石磊泰,李玉華.狂犬病m RNA疫苗的應用和研究進展[J].中國人獸共患病學報,2021,37(12):1123-1128.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.158