王瑞白,許 達(dá),趙秀芹,萬(wàn)康林

非結(jié)核分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria,NTM)是除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)和麻風(fēng)分枝桿菌之外的所有分枝桿菌的總稱,包含有240余菌種。NTM在臨床癥狀、影像學(xué)特征及培養(yǎng)條件上和結(jié)核分枝桿菌很相似,但NTM的耐藥譜和結(jié)核分枝桿菌有很大差異,常規(guī)對(duì)一、二線抗結(jié)核藥物天然耐藥。因此,NTM感染以及其與結(jié)核的混合感染常表現(xiàn)為耐多藥結(jié)核感染,嚴(yán)重增加了治療的難度。因?yàn)槿丝趯W(xué)的變化、影像及檢測(cè)技術(shù)的提高,NTM感染所致“結(jié)核病”的發(fā)病率和疾病負(fù)擔(dān)在全球范圍內(nèi)都有所上升。在美國(guó)等國(guó)家,NTM的流行甚至超過了結(jié)核分枝桿菌。NTM的感染以及與結(jié)核分枝桿菌的混合感染已成為結(jié)核病防控不可忽視的阻力。但與結(jié)核不同,國(guó)內(nèi)外對(duì)NTM都沒有常規(guī)監(jiān)測(cè),NTM的流行狀況基本都是通過系統(tǒng)性回顧研究及Meta分析獲得的,更勿論其與結(jié)核的混合感染。為了解我國(guó)NTM與結(jié)核混合感染的現(xiàn)狀及其對(duì)結(jié)核病防控的影響,我們對(duì)2020年以前的文獻(xiàn)進(jìn)行了數(shù)據(jù)提取及分析。

1 材料與方法

1.1 檢索策略及文獻(xiàn)納入 使用“結(jié)核”和“非結(jié)核分枝桿菌/非典型分枝桿菌”以及《分枝桿菌菌種中文譯名原則專家共識(shí)》(2018)中的181個(gè)非結(jié)核分枝桿菌菌種名對(duì)4個(gè)外文數(shù)據(jù)庫(kù)(BIOSIS,Embase,Pub Med,Web of science)和3個(gè)中文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(知網(wǎng),萬(wàn)方,維普)進(jìn)行題名/關(guān)鍵詞/摘要檢索。

納入標(biāo)準(zhǔn):1)中國(guó)大陸地區(qū)的原始文獻(xiàn);2)受檢樣本為疑似或確診結(jié)核病患者的痰液、血液、腦脊液等,或分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本,有明確的臨床樣本量及分枝桿菌菌株總數(shù);3)對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行了MTBC和NTM的分離鑒定。

排除標(biāo)準(zhǔn):1)直接針對(duì)疑似或已確診為NTM的樣本的研究;2)利用已知菌種的樣本進(jìn)行的檢測(cè)方法的研究;3)個(gè)案報(bào)道;4)同一NTM菌種引起的暴發(fā)及院內(nèi)感染;5)同一地區(qū)及時(shí)間段的重復(fù)性報(bào)道僅納入樣本量最大的一例;6)綜述及沒有全文的會(huì)議摘要等。

1.2 數(shù)據(jù)提取、管理及分析 從文獻(xiàn)中提取以下數(shù)據(jù):樣本的采集時(shí)間及地點(diǎn)、病人及樣本類型、樣本數(shù)量、分離鑒定方法、菌株數(shù)量(結(jié)核、NYM、混合感染)、NTM中快生及慢生菌株數(shù)量、混合感染中的菌種組成、錯(cuò)誤鑒定菌株數(shù)。使用軟件Stata 14(StataCorp,2015)和NoteExpress 3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)管理及Meta分析。異質(zhì)性分析采用I2檢驗(yàn),森林圖用于發(fā)表偏倚的定量評(píng)估,Meta分析采用的是隨機(jī)模型。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到1 725篇中文文獻(xiàn)及7篇英文文獻(xiàn)。題目及摘要篩選,去除1 369篇無(wú)關(guān)文獻(xiàn)。對(duì)剩余的356篇文獻(xiàn)進(jìn)行全文篩選。最終納入193篇中文文獻(xiàn)及2篇英文文獻(xiàn)。納入文獻(xiàn)涉及27個(gè)省市自治區(qū),其中5個(gè)文獻(xiàn)數(shù)最多的省份為廣東(32篇)、江蘇(25篇)、浙江(24篇)、北京(20篇)和上海(14篇)。樣本最早采集時(shí)間為1988年,最長(zhǎng)樣本收集年限為13年。79篇文獻(xiàn)檢測(cè)的是痰液等初始臨床樣本,116篇文獻(xiàn)直接檢測(cè)的分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性樣本或分離到的分枝桿菌菌株。94.02%的文獻(xiàn)樣本收集年限大于1年,80.73%的文獻(xiàn)檢測(cè)的分枝桿菌數(shù)量大于100株(表1)。

表1 納入文獻(xiàn)的年限及樣本量分布Tab.1 Time period and sample size of included literatures

2.2 分枝桿菌菌株分離及菌種鑒定方法 納入文獻(xiàn)中108篇(54.87%)使用了對(duì)硝基苯酸(P-nitrobenzene acid,PNB)和噻吩-2-羧酸聯(lián)氨(thiophene-2-carboxylic acid hydrazine,TCH)鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行TB和NTM的區(qū)分。其中僅使用該方法的57篇,其余50篇結(jié)合了其他分子生物學(xué)的檢測(cè)方法,11篇使用了2種以上的鑒定方法。88篇文獻(xiàn)未使用PNB/TCH實(shí)驗(yàn),采用分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)樣本進(jìn)行的菌種鑒定。其中58篇使用的單一方法,29篇結(jié)合了兩種以上的方法。DNA芯片和16Sr RNA等基因測(cè)序是使用頻率最高的NTM菌種分子生物學(xué)鑒定方法(見表2)。

表2 納入文獻(xiàn)中使用的分枝桿菌鑒定方法Tab.2 Identification methods used in the included literatures

2.3 NTM的分離 對(duì)疑似/確診結(jié)核病患者的初始樣本進(jìn)行檢測(cè)的79篇文獻(xiàn)中,241 188個(gè)樣本中,共分離到84 639株分枝桿菌,其中NTM為9 203株。因此,在疑似/確診結(jié)核病患者中,分枝桿菌的粗分離率為35.4%,NTM的粗分離率為5.2%,在分枝桿菌中的占比為12.7%。在直接對(duì)培陽(yáng)標(biāo)本進(jìn)行鑒定的116篇文獻(xiàn)中,273 504株分枝桿菌中鑒定到NTM 22 361株,NTM的占比為11.8%。兩種文獻(xiàn)類型間的NTM在分枝桿菌中的占比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,合并總效應(yīng)值為12%(11.2%～12.7%)(表3)。

表3 中國(guó)大陸地區(qū)NTM及混合感染分離率及其在分枝桿菌中的占比(%)Tab.3 Isolation rates and proportions in Mycobacterium of NTM and mixed infection in mainland China(%)

納入文獻(xiàn)中97篇進(jìn)行了NTM的菌種鑒定,其中77篇文獻(xiàn)中慢生型NTM多于快生型NTM。在分枝桿菌中,慢生型NTM占60.77%,為我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)型。

2.4 混合感染 195篇納入文獻(xiàn)中有26篇報(bào)道了NTM與結(jié)核的混合感染,其中16篇是對(duì)初始臨床樣本的分析,10篇是對(duì)培陽(yáng)樣本的分析?；旌细腥驹谝伤?確診結(jié)核病人中的分離率為0.6%(0.2%～1.1%),在 分 枝 桿 菌 中 的 占 比 為1.4%(1.1%～1.8%)(表3,圖1)。在耐多藥結(jié)核的1例報(bào)道中,混合感染在分枝桿菌中的占比高達(dá)24.47%[1]。HIV/AIDS合并分枝桿菌感染的2例報(bào)道中,混合感染在分枝桿菌中的占比分別為2.68%和1.03%[2-3]。

圖1 混合感染meta分析森林圖Fig.1 Meta-analysis of mixed infection of NTM and TB

11篇文獻(xiàn)中進(jìn)行了NTM的菌種鑒定。與TB的混合感染中胞內(nèi)分枝桿菌例數(shù)最多,25例,占混合感染的26.9%。其余7種菌種分別為龜分枝桿菌(17例)、膿腫分枝桿菌(15例)、戈登分枝桿菌(11例)、偶發(fā)分枝桿菌(10例)、堪薩斯分枝桿菌(10例)、鳥分枝桿菌(4例)、蟾蜍分枝桿菌(1例)?？焐头种U菌共42例,慢生型51例。

僅1篇文獻(xiàn)對(duì)NTM/TB混合感染的人群特征進(jìn)行了比較分析。其中80例單一NTM感染者的年齡主要集中在20～30歲和40～60歲兩組,而11例NTM/TB混合感染者在30～50歲組最多,男性感染者尤其集中于40～50歲[4]。

3 討 論

我國(guó)NTM的流行呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)式,20年的系統(tǒng)性回顧分析顯示大陸地區(qū)NTM在結(jié)核疑似病例中的粗分離率為4.66%～5.78%,在分枝桿菌中的占比為11.57%[5],本次分析結(jié)果與此一致。NTM在疑似結(jié)核病患者樣本中分離率不足10%,而且NTM是條件致病菌,在樣本中檢出NTM時(shí)分為污染、定殖和致病3種情況,NTM感染的確診,需要對(duì)痰液等樣本重復(fù)取樣復(fù)檢2～3次。因此,最經(jīng)濟(jì)高效的檢測(cè)流程是先初篩,確定是否是分枝桿菌感染,是結(jié)核還是NTM,或兩者的混合感染。在確定樣品中存在NTM后,再進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定。分離到菌株后,可以進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定的方法有不下十余種,包括16S rDNA測(cè)序、特異性PCR擴(kuò)增等,雖然不同方法的靈敏度和特異度不同,但這一步已不是整個(gè)流程中的瓶頸問題。因此如何確定樣本中TB和NTM的存在情況是鑒定的難點(diǎn)。目前,我國(guó)結(jié)核病臨床檢驗(yàn)參考的依據(jù)主要包括《全國(guó)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》(1984版)、《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》(中國(guó)防癆協(xié)會(huì),1995版)及《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》(2015版),依照的也是如上的鑒定思路,即在BACTEC MGIT 960或改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性后,用PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基區(qū)分為人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌與NTM三類,其中人型結(jié)核PNB(－)TCH(＋),牛型結(jié)核PNB(－)TCH(－),NTM PNB(＋)TCH(＋)。之后再利用生化、16S r DNA基因測(cè)序等方法將NTM鑒定到種。該流程成本低廉,對(duì)操作要求不高,適用于基層實(shí)驗(yàn)室,可以解決大部分分枝桿菌的鑒定需求,在我國(guó)結(jié)核病防控工作中發(fā)揮了重要的作用。但其中的PNB/TCH存在3個(gè)主要缺陷:1)基于分枝桿菌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)方法,加上之前960或羅氏培養(yǎng),需要6－8周,非常耗時(shí);2)兩類分枝桿菌對(duì)PNB的敏感性不是絕對(duì)的,存在對(duì)PNB敏感的NTM菌株,也存在耐受PNB的MTBC菌株。PNB實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)判率為10%～20%[6-7];3)不適用于混合感染,NTM在PNB/TCH上都能生長(zhǎng),會(huì)遮蓋MTBC的結(jié)果,故而僅使用該方法的既往研究基本都是僅包含MTBC和NTM,沒有混合感染的數(shù)據(jù),這也是本次分析中195篇納入文獻(xiàn)中僅26篇含混合感染,1篇文獻(xiàn)進(jìn)行了人群特征分析的主要原因。而對(duì)NTM及其與結(jié)核的混合感染關(guān)注度不足,不了解實(shí)驗(yàn)方法的缺陷應(yīng)該是其中存在的主觀因素。

部分研究中用多位點(diǎn)基因擴(kuò)增、斑點(diǎn)雜交、基因芯片等方法取代PNB/TCH實(shí)驗(yàn),用于痰液等初始臨床及培陽(yáng)標(biāo)本的檢測(cè),以縮短檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)的靈敏度和特異度。但其中僅一部分方法適用于混合型樣本。如細(xì)菌鑒定中最常用,也常被視為“金標(biāo)”的16S r DNA基因測(cè)序,顯示的是標(biāo)本中數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)或擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)的菌種的結(jié)果,菌量少的菌種不能顯示,而菌量近似時(shí),測(cè)序會(huì)出現(xiàn)雙峰。針對(duì)細(xì)菌保守基因的PCR擴(kuò)增及檢測(cè),除非是菌種特異性引物,通用型引物都存在類似的問題?；蛐酒?、斑點(diǎn)雜交等是有混合感染檢測(cè)能力的方法,單個(gè)使用或多個(gè)方法的聯(lián)用,雖然可以實(shí)現(xiàn)樣本的精準(zhǔn)鑒定,但檢測(cè)成本比較高,有一定的技術(shù)能力及儀器要求,不適用于基層實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)及大規(guī)模樣本分析。而且其商品化的試劑盒,鑒定范圍多限于臨床常見的20余種NTM菌種,文獻(xiàn)中常見分離的NTM菌株超出試劑盒檢測(cè)范圍的情況,存在一定的漏診率。因此不在于檢測(cè)技術(shù)的新穎性,更適用于基層的分枝桿菌快診新靶標(biāo)的研發(fā)和推廣使用是實(shí)現(xiàn)結(jié)核病精準(zhǔn)診療,從而降低患者的診療負(fù)擔(dān),提高結(jié)核病終止計(jì)劃實(shí)施效率的關(guān)鍵。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:王瑞白,許 達(dá),趙秀芹,等.我國(guó)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌混合感染的系統(tǒng)性回顧及Meta分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2021,37(12):1147-1151.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.161