萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)小鼠醋酸扭體及二甲苯致炎模型的影響

陳穎博 潘 杰 林靜吟 馮小映

萬(wàn)應(yīng)理傷膏由我院“廣東省名中醫(yī)”黃敏院長(zhǎng)的多年臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成，主要由川烏、草烏、半夏等成分組成，具有活血祛瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛的功效，對(duì)各種跌打扭傷、閉合性骨折[1]及各種外傷引起的疼痛[2]有確切的療效，治療有效率達(dá)91.80%[3]。臨床應(yīng)用逾二十年，廣泛用于中醫(yī)骨傷的各種治療，如骨折手法復(fù)位等，在華南地區(qū)享有盛譽(yù)[4]。

萬(wàn)應(yīng)理傷膏為我院內(nèi)部的協(xié)定外用藥，根據(jù)我國(guó)藥品管理的規(guī)定[5-6]，僅限于醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)使用。盡管多年來(lái)的臨床觀察[1-3]提示萬(wàn)應(yīng)理傷膏治療效果良好且不良反應(yīng)少，但因缺乏系統(tǒng)的藥學(xué)臨床科學(xué)研究，極大地限制了其推廣與使用。近年來(lái)，隨著我院業(yè)務(wù)量發(fā)展及知名度提升，萬(wàn)應(yīng)理傷膏的年產(chǎn)量和使用量不斷攀升。為確保藥物的穩(wěn)定性和安全性，我院已逐步開(kāi)展萬(wàn)應(yīng)理傷膏的質(zhì)量控制體系研究，保證各批次的質(zhì)量和安全性達(dá)標(biāo)。然而在藥效學(xué)評(píng)價(jià)方面，卻未曾進(jìn)行動(dòng)物模型方面的探索。本研究是國(guó)內(nèi)首次利用小鼠建模對(duì)萬(wàn)應(yīng)理傷膏進(jìn)行藥效學(xué)方面考察，為評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)痛及抗炎作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

萬(wàn)應(yīng)理傷膏(廣州市正骨醫(yī)院，生產(chǎn)批號(hào) 20200501)；基質(zhì)(卡波姆)；扶他林乳膠膏(北京諾華制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào) VP2526202302)；瑪貝拉脫毛膏(廣州詩(shī)妃化妝品有限公司，生產(chǎn)批號(hào) 20200521)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

8 mm 打孔器，萬(wàn)分位電子分析天平(SHIMADZU，型號(hào) AUW120D)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法[7]

1.4.1 對(duì)小鼠扭體法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)的影響

昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。每天涂藥1次(給藥前1天用脫毛膏脫毛)，基質(zhì)對(duì)照組涂等量的基質(zhì)，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2 mL致痛。觀察并記錄小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期及15 min 內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)，并計(jì)算抑制率和鎮(zhèn)痛率。抑制率=[(給藥組潛伏期均值-模型組潛伏期均值)/模型組潛伏期均值]×100%。鎮(zhèn)痛率=[(模型組扭體次數(shù)均值-給藥組扭體次數(shù)均值)/模型組扭體次數(shù)均值]×100%。

1.4.2 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。每只小鼠右耳廓正反兩面涂以基質(zhì)或藥物，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，精密吸取二甲苯均勻涂于各鼠右耳正反兩面，劑量為每只0.05 mL，左耳不涂作為對(duì)照。二甲苯涂耳1 h后，處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，采用8 mm 直徑打孔器分別于左右耳對(duì)稱部位打下耳片，用精密電子分析天平稱量各鼠耳片質(zhì)量，并計(jì)算腫脹度和抑制率。腫脹度=左耳片重-右耳片重，抑制率=[(模型組腫脹度均值-給藥組腫脹度均值)/模型組腫脹度均值]×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 扭體法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)的影響

2.1.1 對(duì)潛伏期的影響

萬(wàn)應(yīng)理傷膏各劑量組均能明顯延長(zhǎng)冰醋酸所致小鼠首次扭體反應(yīng)的發(fā)生時(shí)間，與基質(zhì)對(duì)照組相比存在非常顯著的差異(P<0.01)。其中，高劑量組的潛伏期最長(zhǎng)，但萬(wàn)應(yīng)理傷膏各劑量組的組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，高劑量組對(duì)小鼠首次扭體反應(yīng)出現(xiàn)的抑制率為53.28%，高于陽(yáng)性對(duì)照扶他林乳膏組8.02%。萬(wàn)應(yīng)理傷膏各劑量組潛伏期與扶他林乳膏組相比，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

表1 萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)冰醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)潛伏期的影響

圖1 萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)冰醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)潛伏期的影響

2.1.2 15 min內(nèi)扭體的次數(shù)

萬(wàn)應(yīng)理傷膏各劑量組均能有效降低小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與基質(zhì)對(duì)照組相比存在非常顯著的差異(P<0.01)。其中，高劑量組與低劑量組相比，結(jié)果存在顯著差異(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。就萬(wàn)應(yīng)理傷膏而言，低、中劑量組對(duì)冰醋酸所致的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)有抑制趨勢(shì)，而高劑量組則能明顯減少扭體反應(yīng)的次數(shù)。此外，高劑量組鎮(zhèn)痛率較陽(yáng)性對(duì)照扶他林乳膏組高7.79%。但各劑量組扭體次數(shù)與扶他林乳膏組相比，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。

表2 萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)冰醋酸所致小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)的影響

圖2 萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)冰醋酸所致小鼠15 min內(nèi)扭體次數(shù)的影響

2.2 二甲苯致耳腫脹的影響

小鼠二甲苯致炎后，耳廓出現(xiàn)腫脹，萬(wàn)應(yīng)理傷膏各劑量組均呈現(xiàn)對(duì)炎癥的良好抑制作用，與基質(zhì)對(duì)照組相比存在非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。其中，抗炎作用最明顯的是高劑量組，腫脹抑制率為47.06%，但各劑量組的組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，高劑量組抑制率與陽(yáng)性對(duì)照扶他林乳膏組相比，略高1.18%，但組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3、表3。

表3 萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

圖3 萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

3 討論

急性軟組織損傷早期引起的紅、腫、熱、痛等臨床癥狀，是由急性外傷或直接暴力作用于機(jī)體而引起的無(wú)菌性炎癥。臨床上主要采用非甾體抗炎藥、人工合成鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)激素等藥物治療。但這些藥物副作用較大，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)人體多個(gè)系統(tǒng)造成影響。萬(wàn)應(yīng)理傷膏為我院中藥制劑，多年來(lái)用于治療急性軟組織損傷臨床療效佳，不良反應(yīng)少，深受醫(yī)生和患者認(rèn)可。本研究選用扶他林乳膏作陽(yáng)性對(duì)照藥物，因其在國(guó)內(nèi)外上市多年，臨床數(shù)據(jù)充分[8-12]，療效明確。而萬(wàn)應(yīng)理傷膏的售價(jià)僅為扶他林乳膏的二分之一，是臨床用藥的有益補(bǔ)充。

扭體法以冰醋酸作為化學(xué)刺激評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛效果至今已沿用多年[13-17]，常用作評(píng)估藥物的外周鎮(zhèn)痛活性[18-19]。因其具備操作簡(jiǎn)便，不需特殊設(shè)備、復(fù)制成功率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外研究實(shí)驗(yàn)[19-25]，方法成熟可靠[16, 26]。本研究采用扭體法觀察萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用，以小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)潛伏期和15 min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)作為評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛效果的指標(biāo)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，觀察扭體次數(shù)比潛伏期更為敏感，能體現(xiàn)萬(wàn)應(yīng)理傷膏不同劑量的組間鎮(zhèn)痛效果差異。低劑量組呈現(xiàn)一定的鎮(zhèn)痛作用，隨著萬(wàn)應(yīng)理傷膏劑量增加，鎮(zhèn)痛效果逐步增強(qiáng)，呈劑量依賴性，作用最強(qiáng)的是高劑量組。此外，兩指標(biāo)間存在相關(guān)性。潛伏期(即首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時(shí)間)越長(zhǎng)，小鼠在15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體的次數(shù)越少，兩者結(jié)合評(píng)價(jià)更能體現(xiàn)萬(wàn)應(yīng)理傷膏的鎮(zhèn)痛作用。

本研究設(shè)定的實(shí)驗(yàn)組劑量和療程均在安全范圍內(nèi)，結(jié)果顯示高劑量組的鎮(zhèn)痛效果最優(yōu)，提示萬(wàn)應(yīng)理傷膏的臨床治療劑量可設(shè)定為一日5次，以提高嚴(yán)重腫痛患者的療效。周敏杰在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中提到，萬(wàn)應(yīng)理傷膏以生川烏和生草烏作為君藥，加入天然冰片、薄荷腦等引藥[27]，產(chǎn)生協(xié)同鎮(zhèn)痛的作用。筆者認(rèn)為，鑒于生川烏、生草烏的毒性較大，除了需在制劑生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)其含量嚴(yán)格控制外，臨床治療劑量和療程的制定也同樣重要。使用劑量過(guò)大或療程太長(zhǎng)，可能會(huì)累積產(chǎn)生毒副作用。今后應(yīng)深入開(kāi)展萬(wàn)應(yīng)理傷膏的毒理學(xué)研究，以更好地指導(dǎo)合理用藥，避免不良反應(yīng)，提高臨床藥物治療水平。

在小鼠急性炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，采用二甲苯致小鼠耳腫脹來(lái)初步考察萬(wàn)應(yīng)理傷膏的抗炎作用。谷捷等[28]提出在中藥創(chuàng)新藥研究中，應(yīng)用二甲苯致炎模型與臨床常見(jiàn)急性炎癥相似，廣泛用于中藥抗炎創(chuàng)新藥物的抗炎效應(yīng)評(píng)價(jià)，也常被藥理學(xué)等課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)所選用。本研究結(jié)果顯示萬(wàn)應(yīng)理傷膏抗炎作用明顯，中、高劑量的作用強(qiáng)度相似或高于扶他林乳膏。由此表明，在急性創(chuàng)傷所致的皮膚組織炎癥中，使用中、高劑量治療(一日3～5次)將獲得良好的抗炎效果。

盡管本研究取得了一些有價(jià)值的結(jié)果，但仍存在局限性。本次研究中，尚未開(kāi)展小鼠熱板刺激實(shí)驗(yàn)[29]，未測(cè)定萬(wàn)應(yīng)理傷膏對(duì)熱刺激產(chǎn)生組織損傷所致疼痛的抑制作用。熱板刺激實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估藥物的中樞鎮(zhèn)痛作用[18]，與評(píng)估外周鎮(zhèn)痛作用的扭體法結(jié)合，可以很好地評(píng)價(jià)萬(wàn)應(yīng)理傷膏治療疼痛的效果。它的缺乏，將影響萬(wàn)應(yīng)理傷膏的整體疼痛評(píng)價(jià)。此外，O V Sintsova等[30]在最新的研究中指出，TPRV1受體阻斷劑在熱板刺激實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)較長(zhǎng)的鎮(zhèn)痛作用。TPRV1是近年研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為治療疼痛和皮膚炎癥[31]的有效靶點(diǎn)。熱板刺激實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)，有利于明確萬(wàn)應(yīng)理傷膏發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的部位和機(jī)制。因此，我院將繼續(xù)開(kāi)展鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究，逐步充實(shí)萬(wàn)應(yīng)理傷膏的藥學(xué)臨床科學(xué)研究基礎(chǔ)。

綜上所述，在小鼠建模中萬(wàn)應(yīng)理傷膏初步展現(xiàn)良好的抗急性炎癥作用和鎮(zhèn)痛作用，藥效學(xué)研究結(jié)果與臨床療效相符。今后仍需進(jìn)一步探討物理刺激(熱刺激)引起疼痛的抑制效果，并推進(jìn)藥物安全性研究，建立藥效學(xué)、毒理學(xué)、臨床藥理學(xué)等方面的評(píng)價(jià)。同時(shí)，開(kāi)展臨床研究，觀察藥物不良反應(yīng)，以明確各種適應(yīng)癥的治療劑量范圍。