巨噬細(xì)胞起源、活化和功能異質(zhì)性在放射性肺損傷中的作用研究進(jìn)展①

張妮 楊揆 白健 秦鴻雁

（空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)教研室，西安710032）

放療是治療肺癌、食管癌、乳腺癌等胸部腫瘤的有效手段之一。放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部腫瘤放射治療過(guò)程中最常見(jiàn)的并發(fā)癥，包括早期的放射性肺炎（radiation pneumonitis，RP）和晚期的放射性肺纖維化（radia?tion-induced lung fibrosis，RILF）兩個(gè)階段［1-2］。暴露于電離輻射下的肺組織不僅出現(xiàn)DNA損傷，且受損的肺泡上皮細(xì)胞可釋放大量炎癥因子導(dǎo)致肺臟組織微環(huán)境改變，進(jìn)一步引發(fā)肺部炎癥和肺纖維化。其中，炎癥細(xì)胞，尤其是單核-巨噬細(xì)胞在肺組織炎癥反應(yīng)起始階段到纖維化重塑階段均發(fā)揮重要調(diào)控作用［3-5］。近期利用細(xì)胞命運(yùn)示蹤技術(shù)結(jié)合動(dòng)物損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是一群具有起源、活化和功能高度異質(zhì)性的固有免疫細(xì)胞。在肺臟中存在幾種不同的巨噬細(xì)胞亞群：有駐留在肺泡和間質(zhì)的巨噬細(xì)胞，也有在損傷后由血液?jiǎn)魏思?xì)胞遷移至肺臟分化而成的巨噬細(xì)胞［6］。此外，在不同的微環(huán)境因子刺激下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的活化模式，并呈現(xiàn)出不同的功能。如經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎和抗纖維化作用，而替代活化的M2型巨噬細(xì)胞則發(fā)揮抗炎和促纖維化作用［7］。

1 巨噬細(xì)胞起源異質(zhì)性與RILI

長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為組織定居巨噬細(xì)胞都是由骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞分化而來(lái)。但近期利用細(xì)胞命運(yùn)示蹤小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是一群具有起源異質(zhì)性的固有免疫細(xì)胞。除小腸、皮膚巨噬細(xì)胞自成體后來(lái)源于骨髓造血單核細(xì)胞外，絕大多數(shù)的組織定居巨噬細(xì)胞并非來(lái)源于成體后骨髓單核細(xì)胞，而是來(lái)源于胚胎時(shí)期的卵黃囊和/或胎肝，并持續(xù)至個(gè)體發(fā)育成熟［8-9］。如腦的小膠質(zhì)細(xì)胞起源于卵黃囊紅系-巨噬前體細(xì)胞，皮膚朗格漢氏和肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞起源于卵黃囊和胎肝造血干細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞和脾臟紅髓巨噬細(xì)胞起源于胚胎造血干細(xì)胞。這些組織定居巨噬細(xì)胞在靜息或炎癥狀態(tài)下可進(jìn)行原位增殖和自我更新，其不依賴(lài)或部分依賴(lài)于骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞貢獻(xiàn)［10-11］。

靜息態(tài)下的肺臟巨噬細(xì)胞由分布于肺泡腔的肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AMs，siglecF+CD11b-F4/80+CD11c+）和分布于間質(zhì)的肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（interstitial macrophages，IMs，siglec-CD11b+F4/80+CD11c-）組成［12］。其中，組織定居的AMs起源于胚胎時(shí)期的卵黃囊階段，具有自我更新能力，占肺臟巨噬細(xì)胞的75%，在維持免疫耐受中發(fā)揮重要作用［13-14］。而IMs既起源于卵黃囊期也起源于骨髓單核細(xì)胞，其更新依賴(lài)于骨髓單核細(xì)胞，構(gòu)成近9%的脈管外髓系細(xì)胞，具有吞噬和清除進(jìn)入肺間質(zhì)異物的能力［15-17］。在炎癥包括放射誘導(dǎo)的肺損傷情況下，肺臟巨噬細(xì)胞除了由AMs和IMs組成外，還包括在損傷后由血液?jiǎn)魏思?xì)胞遷移至肺臟分化而成的巨噬細(xì)胞［6］。RILI后AMs和IMs處于動(dòng)態(tài)變化中。在接受輻照15 d后，AMs的數(shù)目降到最低，直到16周，AMs細(xì)胞水平再次上升。而位于肺間質(zhì)的IMs在輻照后第6天達(dá)到峰值，隨后下降至穩(wěn)定水平，直到輻照16周后，IMs細(xì)胞數(shù)目再次上升。在輻射15 d后，AMs大量死亡耗盡，而IMs不僅沒(méi)有減少，其數(shù)量還有增加，表明IMs可能比AMs具有更強(qiáng)的抗輻射能力或者骨髓的單核細(xì)胞替代補(bǔ)充更加迅速［18-21］。而且大量研究表明這些炎性巨噬細(xì)胞可以轉(zhuǎn)換成IMs和AMs進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用［4，22-23］。然而，這些不同起源的肺臟巨噬細(xì)胞是通過(guò)何種機(jī)制參與RILI與RILF的過(guò)程，尚有待進(jìn)一步研究。

2 巨噬細(xì)胞活化模式與RILI

研究表明，巨噬細(xì)胞是一類(lèi)可塑性強(qiáng)，免疫功能多樣的細(xì)胞亞群。在不同的微環(huán)境、不同的刺激因子下表現(xiàn)為不同的活化狀態(tài)［24-25］。即經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞。而M2型的巨噬細(xì)胞又依據(jù)其誘導(dǎo)分子和功能表型分為抗炎型M2a、免疫調(diào)節(jié)型M2b和創(chuàng)傷愈合型M2c。M1型巨噬細(xì)胞的激活依賴(lài)于細(xì)菌產(chǎn)物脂多糖（LPS）、IFN-γ或IL-12等刺激，具有清除細(xì)菌、釋放促炎因子如IL-12、TNF-α、IL-1β和ROS以及降解細(xì)胞外基質(zhì)等功能；M2型巨噬細(xì)胞的激活依賴(lài)于IL-4、IL-13和IL-10等刺激，具有抵御寄生蟲(chóng)感染、促進(jìn)組織修復(fù)和釋放免疫調(diào)節(jié)因子如IL-10、IL-4、IL-13和TGF-β以及分泌組織抑制因子（TIMP-1）拮抗金屬基質(zhì)蛋白等功能［26］。然而，來(lái)源于體外研究的M1/M2活化模式并不能真實(shí)地反映體內(nèi)觀察到的巨噬細(xì)胞表型。近期由于表觀遺傳學(xué)、基因表達(dá)和功能研究上的技術(shù)和分析方法進(jìn)步，揭示了巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)是一個(gè)超出M1/M2型巨噬細(xì)胞活化模式的譜系變化［27］。在不同微環(huán)境因子刺激下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的活化模式，并呈現(xiàn)出不同的功能。如經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎和抗纖維化作用，而替代活化的M2型巨噬細(xì)胞則發(fā)揮抗炎和促纖維化作用［28］。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，在RILI的早期RP階段，巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為M1型活化，釋放細(xì)胞因子如IL-12，TNF-α、IL-1β和ROS等，以清除病原菌的作用。但在纖維化起始和進(jìn)展期，巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為M2型活化。M2型肺巨噬細(xì)胞一方面在肺纖維化起始階段釋放ROS和分泌MMP-10、MMP-13、MMP-28，級(jí)聯(lián)放大肺泡上皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡［29］；另一方面在肺纖維化進(jìn)展期，M2型肺巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放促纖維化細(xì)胞因子TGF-β和Arg1，作用于肺內(nèi)的成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，加重肺纖維化［30］。同樣，在肺間質(zhì)纖維化患者中，M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物呈現(xiàn)高表達(dá)［30-31］。M1巨噬細(xì)胞的增多主要發(fā)生在放射誘導(dǎo)肺炎癥階段，在進(jìn)展到肺纖維化階段，巨噬細(xì)胞主要為M2型。因而LI等［32］將M2型巨噬細(xì)胞回輸給巨噬細(xì)胞清除后的經(jīng)輻照的肺臟組織，則肺纖維化再次重建。而回輸M1型巨噬細(xì)胞對(duì)肺纖維化沒(méi)有影響。提示M2型巨噬細(xì)胞在輻照誘導(dǎo)的肺損傷尤其是肺纖維化形成中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。目前大量臨床肺纖維化患者研究支持了M2型肺泡巨噬細(xì)胞在纖維化中的作用［33］。因而，在RILI與RILF中巨噬細(xì)胞被分為促炎型和修復(fù)型兩種類(lèi)型，對(duì)肺臟的損傷和修復(fù)發(fā)揮“雙刃劍”作用。然而，在RILI與RILF中調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2活化的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3 巨噬細(xì)胞活化和功能調(diào)控與RILI

機(jī)體可以通過(guò)多種機(jī)制參與巨噬細(xì)胞活化和功能的調(diào)控，如以細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)途徑（IL-4、IL-13等）、胞內(nèi)信號(hào)途徑（JAK-STAT、NF-κB和Notch信號(hào)等）、轉(zhuǎn)錄因子（PPAR-γ、KLF4、IRF5和HIF-1α）介導(dǎo)以及一些表觀遺傳修飾等機(jī)制［33-34］。IL-13和IL-4分別與巨噬細(xì)胞膜表面的受體IL-13R和IL-4R結(jié)合，激活下游經(jīng)典的JAK-STAT6信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型活化，發(fā)揮抗炎和促修復(fù)作用［35］。HE等［36-37］利用Cu，Zn-SOD-/-小鼠研究肺纖維化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在野生小鼠中線粒體Cu，Zn-SOD介導(dǎo)的H2O2大量產(chǎn)生誘發(fā)DNA受損，進(jìn)而增強(qiáng)STAT6轉(zhuǎn)錄，促使巨噬細(xì)胞向M2型極化而導(dǎo)致肺纖維化。之后利用Cu，Zn-SOD轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步證明了此現(xiàn)象。提示Cu，Zn-SOD通過(guò)STAT6調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型極化而參與肺纖維的進(jìn)展。近期，TAO等［38］利用博來(lái)霉素結(jié)合髓系Shp2條件性剔除小鼠建立肺纖維化模型發(fā)現(xiàn)，Shp2缺失導(dǎo)致IL-4介導(dǎo)的JAK1/STAT6信號(hào)活化進(jìn)而誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞活化而加重肺纖維化。而ARRAS等［39］在二氧化硅顆粒誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，IL-9通過(guò)抑制M2巨噬細(xì)胞極化而發(fā)揮抗纖維化作用。長(zhǎng)期慢性過(guò)表達(dá)IL-10的小鼠同樣通過(guò)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化和誘導(dǎo)CCR2-CCL2的表達(dá)而自發(fā)肺纖維化［40］。ZHAO等［41］研究同樣表明在放療誘導(dǎo)的肺纖維化中g(shù)alec?tin-3的高表達(dá)與M2型巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)。敲低巨噬細(xì)胞系galectin-3可降低M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物YM1的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)均提示，細(xì)胞因子信號(hào)誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞在不同因素誘導(dǎo)的肺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

4 以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗纖維化治療的前景

目前，激素和抗生素的常規(guī)治療雖然能在一定程度上改善患者癥狀，但不良反應(yīng)較多，且對(duì)已進(jìn)展到肺纖維化的患者療效甚微，因此，積極探尋新的治療策略對(duì)RILI具有重要意義。巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量抗氧化分子，如錳超氧化物歧化酶（Mn?SOD），超氧離子（O2-）等，是人類(lèi)細(xì)胞中抵御輻射能力較強(qiáng)的細(xì)胞之一［41］。因此，針對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防或治療RILI成為一種新的治療策略。有研究者利用集落刺激因子1受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）的單克隆抗體特異性清除IM，可防治RILF［18，21］。抑制CCL2/CCR2信號(hào)軸，可阻止單核細(xì)胞遷移進(jìn)入受輻照部位的肺組織，減輕肺纖維化［42］。因此，減少損傷肺組織中促進(jìn)纖維化的M2型巨噬細(xì)胞可以作為預(yù)防和治療RILI的潛在靶點(diǎn)。另一種治療策略是將巨噬細(xì)胞重編程和免疫系統(tǒng)再教育，使巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗纖維化的“好”的作用，從而減輕RILI。在腫瘤模型中，使用低劑量放射線可使巨噬細(xì)胞再教育為具有抗腫瘤作用的“好”的巨噬細(xì)胞［43］。在RILI中，也可通過(guò)將促纖維化的M2型巨噬細(xì)胞教育為“好”抗纖維化的M1巨噬細(xì)胞，從而防治放射性肺損傷［18］。因此，精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)和調(diào)控放射誘導(dǎo)的肺臟巨噬細(xì)胞的活化表型可能是防治RILI與RILF的新策略。

近期，本課題組利用巨噬細(xì)胞特異剔除Notch信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J的小鼠建立博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型，進(jìn)行組織Masson和天狼猩紅染色發(fā)現(xiàn)：在肺纖維化模型中，敲除RBP-J的小鼠間質(zhì)纖維化程度減輕。同時(shí)Notch信號(hào)減少了促纖維化的骨髓單核來(lái)源的肺泡巨噬細(xì)胞（MO-AMs）的募集和TGF-β的分泌，減輕小鼠肺纖維化。這些研究提示，靶向巨噬細(xì)胞的Notch信號(hào)可能是治療肺纖維化的新靶點(diǎn)。骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞募集到受損傷的組織主要依靠CCR2-CCL2分子信號(hào)軸，抑制CCR2-CCL2的信號(hào)軸可有效減輕小鼠博來(lái)霉素和RILI誘導(dǎo)的肺纖維化［42］。但抗CCL2的2期臨床試驗(yàn)現(xiàn)已經(jīng)提前終止，原因是患者預(yù)后沒(méi)有明顯改變，并出乎意料地導(dǎo)致其CCL2水平升高［44］。靶向受體CCR2減輕肺纖維化還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。但有一個(gè)CCR2/CCR5雙重拮抗劑目前正處于肝纖維化的臨床試驗(yàn)階段［45］。另外，IMs是輻射誘發(fā)的肺纖維化的主要驅(qū)動(dòng)因素，IMs高表達(dá)CSF1R，因此CSF1R是治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)。由于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞也高表達(dá)CSF1R，CSF1R的抑制劑正在進(jìn)行腫瘤患者的臨床試驗(yàn)［46］，從而預(yù)估其在肺纖維化中治療中的作用。因此，盡管巨噬細(xì)胞在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但由于其起源和功能的異質(zhì)性，仍然需要更多、更深入的研究，這對(duì)于優(yōu)化以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗纖維化干預(yù)措施具有重要意義。

放療是治療腫瘤的重要措施，通過(guò)聯(lián)合其他治療方法可提高腫瘤患者的生存期。RILI是其嚴(yán)重的并發(fā)癥，更直接威脅腫瘤患者的生存質(zhì)量，從而抵消放療帶來(lái)的益處，嚴(yán)重者甚至危及生命。揭示不同起源、活化模式和功能異質(zhì)性的巨噬細(xì)胞在RILI與RILF中的作用及調(diào)控機(jī)制有望為肺纖維化的治療提供新策略和新思路。