趙霞 楊倩 劉志何 高燕 肖淑欣（青島大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，青島266000）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是臨床最常見的自身免疫性出血性疾?。?-2］。研究證明，慢性ITP是一種以Th1細胞異常聚集為特征的Th1優(yōu)勢性自身免疫性疾?。?-4］。Th1和Th2細胞分別表達不同的趨化因子受體，并與不同的趨化因子結(jié)合，其中Th1細胞優(yōu)勢性表達CXCR3、CCR5，Th2細胞優(yōu)勢性表達CCR3，從而調(diào)控Th1和Th2細胞活化與極化［5］。在CD4+T淋巴細胞表面，以上趨化因子受體可作為區(qū)分Th1和Th2細胞的標(biāo)志物［6］。盡管目前ITP發(fā)病機制的研究較多，但多數(shù)是基于混合淋巴細胞培養(yǎng)的研究，本 文 旨 在 研 究CCR3、CCR5、CXCR3在ITP患 者CD4+T淋巴細胞表面的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象選取2017年7月至2019年6月我院新診斷ITP患者40例，其中男性18例，女性22例，中位年齡［35（18~60）］歲，中位血小板計數(shù)（PLT）為［18（5~29）］×109L-1，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻［1］。以20名健康志愿者為對照，其中男性8例，女性12例，中位年齡［33（21~48）］歲，中位PLT［180（135~280）］×109L-1。所有研究對象知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；Ficoll分離液（天津灝洋化學(xué)試劑有限公司）；植物血凝素（PHA，終濃度50 mg/L，Sigma公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；SYBR Green PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；細胞總蛋白抽提試劑盒（DBI-1017，Ⅳ型，美國DBI公司）；Bradford試劑盒（P0006，碧云天）；硝酸纖維素膜（NC膜，武漢博士德公司）；麗春紅染色液（武漢博士德公司）；Western blot-抗稀釋液（碧云天）；CD4-FITC（Dyclone）；α-Tublin抗體（美國DBI公司）；抗FITC免疫磁珠（Miltenyi Biotec）；磁性細胞分離柱（Milte?nyi Biotec）；VarioMACS磁性分離器（Miltenyi Bio?tec）；FACScan流式細胞儀（美國Becton-Diskinson公司）；熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7500，美國Ap?plied Biosytems公司）；多功能凝膠圖像成像儀（Al?pha Innotec公司）。

1.2 方法

1.2.1 臨床治療方案給予40例ITP患者潑尼松治療，起始劑量為1.0 mg/（kg·d），對初始PLT<10×109L-1或有明顯出血患者同時給予人免疫球蛋白0.4 g/（kg·d），連續(xù)3~5 d，病情穩(wěn)定后快速減至最小維持量（<15 mg/d），如治療4周PLT<30×109L-1或PLT增加<基礎(chǔ)值的2倍或有出血，說明潑尼松治療無效，迅速減量至停用。治療過程中給予止血藥物防治出血以及輸注血小板等對癥治療。34例患者接受激素治療后，PLT1周左右上升至正常水平（5~14 d），為激素治療有效；6例患者激素治療無效，迅速減量至停用，采用二線或其他治療方案。

1.2.2 外周血單個核細胞分離、凍存及復(fù)蘇肝素抗凝管采集晨起健康志愿者及治療前后2周ITP患者外周血，F(xiàn)icoll分離液密度梯度分離外周血單個核細胞，重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為1×107個/ml，凍存，含20%DMSO的RPMI1640培養(yǎng)液與等體積外周血單個核細胞懸液混合，快速分裝于低溫保存管中，4℃放置15 min，降溫儀程序控制降溫。復(fù)蘇細胞時以1℃/min速度降至-20℃，再以4℃/min降至-80℃，投入-196℃液氮中。自液氮取出細胞標(biāo)本后立即于37℃水浴箱中快速復(fù)溫，待標(biāo)本即將溶化時，加入RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細胞1次，調(diào)整細胞濃度至1×107個/ml，0.2%臺盼藍染色，計算細胞拒染率。

1.2.3 外周血CD4+T淋巴細胞分選復(fù)蘇后的單個核細胞懸液4℃孵育15 min，加入CD4-FITC 4℃孵育60 min，PBS沖洗，去上清，加入抗FITC免疫磁珠4℃孵育60 min，輕輕振蕩，10 min/次，PBS沖洗并稀釋，過磁性細胞分離柱，VarioMACS磁性分離器分離細胞，調(diào)整細胞密度至1×106個/ml，F(xiàn)ACScan流式細胞儀檢測其表面標(biāo)志物，調(diào)整細胞密度至1×106個/ml，重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入植物血凝素培養(yǎng)備用。

1.2.4 RT-PCR檢測CCR3、CCR5、CXCR3基因表達TRIzol試劑提取CD4+T淋巴細胞總RNA，采用熒光定量PCR儀進行PCR檢測，以β-actin為內(nèi)參；CCR3、CCR5、CXCR3上下游引物由TaKaRa公司設(shè)計，上海生物工程有限公司合成（表1）。采用兩步法PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)。各樣本設(shè)3個復(fù)孔，2-ΔΔCt法計算。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測CCR3、CXCR3、CCR5蛋白表達細胞總蛋白抽提試劑盒抽提分離得到CD4+T淋巴細胞細胞總蛋白，Bradford試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，將等量ITP患者組與對照組蛋白加入SDS-PAGE上樣孔內(nèi)，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至NC膜，麗春紅染色液染色觀察轉(zhuǎn)膜效果。加入50 g/L脫脂奶粉搖床室溫封閉60 min，Western blot-抗稀釋液稀釋兔抗CCR3抗體（1∶1 000）、兔抗CCR5抗體（1∶500）、兔抗CXCR3抗體（1∶1 000），以α-Tublin抗體為內(nèi)參，4℃封閉過夜，TBS-T緩沖液（含20%Tween20的TBS緩沖液）洗膜3次，10 min/次，加入稀釋的（1∶5 000）辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育90 min，TBST緩沖液洗膜，ECL顯色定影，多功能凝膠圖像成像儀獲取蛋白掃描圖片，ScnImage軟件調(diào)整圖片并進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，CCR3、CCR5、CXCR3蛋白及mRNA表達以±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析進行SNK?q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血T淋巴細胞分選、鑒定健康志愿者及ITP患者外周血單個核細胞凍存復(fù)蘇后細胞仍有較高活性，細胞回收率約為75%，采用免疫磁珠法分選出CD4+T淋巴細胞后，流式細胞儀測定其純度高達93%以上（表2）。

表2 免疫磁珠分選前后CD4+T淋巴細胞純度（xˉ±s，%）Tab.2 CD4+T lymphocyte purity before and after immunomagnetic bead sorting（xˉ±s，%）

2.2 ITP患者治療前后及健康志愿者CCR3、CCR5、CXCR3 mRNA表達RT-PCR結(jié)果顯示，ITP患者治療前CD4+T淋巴細胞Th1細胞趨化因子受體CCR5、CXCR3 mRNA表達顯著高于正常對照組（P<0.05），ITP患者治療后CD4+T淋巴細胞Th1細胞趨化因子受體CCR5、CXCR3 mRNA表達顯著低于治療前（P<0.05），而ITP患者治療前CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3 mRNA表達顯著低于正常對照組（P<0.05），ITP患者治療后CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3 mRNA表達顯著高于治療前（P<0.05，表3）。

表3 ITP患者及正常對照CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA表達（±s）Tab.3 CXCR3，CCR5 and CCR3 mRNA expressions of patients with ITP and normal controls（±s）

表3 ITP患者及正常對照CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA表達（±s）Tab.3 CXCR3，CCR5 and CCR3 mRNA expressions of patients with ITP and normal controls（±s）

Note：1）P<0.05 vs Control；2）P<0.05 vs After treatment.

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2.3 ITP患者激素治療后不同療效組CCR3、CCR5、CXCR3 mRNA表達RT-PCR結(jié)果顯示，ITP患者治療有效組治療后CD4+T淋巴細胞Th1細胞趨化因子受體CCR5、CXCR3 mRNA表達與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），治療無效組患者治療后CCR5、CXCR3 mRNA表達顯著高于對照組和有效組（P<0.05）；而ITP患者治療有效組治療后CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3 mRNA表達與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），治療無效組患者治療后CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3 mRNA表達顯著低于對照組和有效組（P<0.05，表4）。

表4 糖皮質(zhì)激素治療后不同療效組ITP患者CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA表達（±s）Tab.4 CXCR3，CCR5 and CCR3 mRNA expressions of patients with ITP treated with different therapeu?tic effects after glucocorticoid therapy（±s）

表4 糖皮質(zhì)激素治療后不同療效組ITP患者CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA表達（±s）Tab.4 CXCR3，CCR5 and CCR3 mRNA expressions of patients with ITP treated with different therapeu?tic effects after glucocorticoid therapy（±s）

Note：1）P<0.05 vs Control；2）P<0.05 vs Effective.

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2.4 ITP患者治療前后及正常對照細胞趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR3蛋白表達ITP患者治療前CD4+T淋巴細胞Th1細胞趨化因子受體CCR5、CXCR3膜蛋白表達較健康志愿者顯著升高（P<0.05），ITP患者治療后CD4+T淋巴細胞Th1細胞趨化因子受體CCR5、CXCR3膜蛋白表達較治療前顯著降低（P<0.05）；ITP患者治療前CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3蛋白表達較健康志愿者顯著降低（P<0.05），ITP患者治療后CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3蛋白表達較治療前顯著升高（P<0.05，表5）。

表5 ITP患者治療前后及正常對照組外周血CD4+T淋巴細胞CCR3、CCR5、CXCR3蛋白表達（±s）Tab.5 Protein expressions of CCR3，CCR5 and CXCR3 in CD4+T lymphocyte of patients with ITP and normal controls（±s）

Note：1）P<0.05 vs Control；2）P<0.05 vs After treatment.

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3 討論

ITP是一種獲得性自身免疫性疾病，目前認(rèn)為其發(fā)病機制與免疫系統(tǒng)相關(guān)，即自身抗體對抗自身血小板，導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（尤其是脾內(nèi)巨噬細胞）通過Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用增強，血小板破壞增加［7］。盡管其病理過程由自身抗體介導(dǎo)，但研究表明ITP患者抗血小板自身抗體受輔助性T細胞和細胞因子調(diào)控［8］。細胞免疫異常在ITP病理生理過程中起關(guān)鍵作用。

ITP患者體內(nèi)存在T細胞亞群、細胞因子及細胞趨化因子受體等異常。T淋巴細胞是一種重要的免疫活性細胞，在免疫反應(yīng)中起重要作用，是細胞免疫和體液免疫的重要環(huán)節(jié)。按功能可分為輔助性T細胞（Th）、誘導(dǎo)性T細胞（Ti）、抑制性T細胞（Ts）和殺傷性T細胞（Tc）。按所分泌的細胞因子不同，Th細胞可分為Th1和Th2細胞2個亞群。Th細胞向免疫發(fā)生部位遷移是多細胞因子參與的復(fù)雜過程，趨化因子是一種具有趨化作用的細胞因子，在調(diào)控免疫細胞定向遷移方面具有重要作用。趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的GTP蛋白偶聯(lián)的跨膜受體（GPCRs），通常表達于免疫細胞和內(nèi)皮細胞膜上。根據(jù)配體不同可將趨化因子受體分為4個亞家族：CXC類受體（CXCR）、CC類受體（CCR）、C類受體（CR）和CX3C類受體（CX3CR）［9］。研究表明，細胞趨化因子及其受體在Th細胞極化方面具有重要作用［10］。T淋巴細胞極化為Th1或Th2細胞是細胞應(yīng)答的重要特征，趨化因子可通過誘導(dǎo)Th0細胞定向分化為Th1細胞或Th2細胞，Th1細胞特征性表 達CCR5、CXCR3，受 趨化 因子 如CCL3、CCL5（RANTES）、CCL9（MIG）和CXCL10（IP210）趨化至病變組織，并分泌多種趨化因子以募集更多淋巴細胞，引發(fā)Th1型炎癥反應(yīng)［11-12］。Th2細胞特征表達CCR3、CCR4、CCR8，在趨化因子CCL11、24、26（eo?taxin21、2、3）、CCL8、7、13（MCP22、3、4）作用下進入損傷組織，引發(fā)Th2型炎癥反應(yīng)［13］。

研究證實，多種自身免疫性疾病及淋巴造血系統(tǒng)等疾病發(fā)生均與細胞趨化因子及其受體異常有關(guān)［14-17］。Th1型趨化因子受體CXCR3和CCR5在ITP患者脾臟中高表達，提示Th1型趨化因子受體CX?CR3和CCR5參與ITP脾臟免疫反應(yīng)［18］。但ITP患者外周血CD4+T淋巴細胞膜趨化因子受體異常及在治療過程的變化等情況鮮有報道。

本研究采用免疫磁珠分選CD4+T淋巴細胞，RTPCR檢測ITP患者治療前后與正常對照組外周血CD4+T淋巴細胞CCR3、CCR5、CXCR3表達，Western blot法檢測ITP患者治療前后與正常對照組外周血CD4+T淋巴細胞CCR3、CCR5、CXCR3蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITP患者治療前CD4+T淋巴細胞CCR5、CX?CR3 mRNA水平較健康志愿者顯著升高，治療后較治療前顯著降低；而ITP患者治療前CCR3 mRNA水平較健康志愿者顯著降低，治療后較治療前顯著升高，Western blot檢測結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果一致。對比激素治療有效和無效ITP患者及正常對照組RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITP患者治療有效組治療后CD4+T淋巴細胞Th1細胞趨化因子受體CCR5 mRNA、CXCR3 mRNA可降低至正常水平，但治療無效組治療后CCR5、CXCR3 mRNA水平顯著高于正常對照組；ITP患者治療有效組治療后CD4+T淋巴細胞Th2細胞趨化因子受體CCR3 mRNA水平可上升至正常水平，但治療無效組治療后仍顯著低于正常對照組，因此推測當(dāng)免疫反應(yīng)受到調(diào)節(jié)異常時，ITP患者Th1細胞趨化因子受體CCR5、CXCR3表達上調(diào)，而Th2細胞趨化因子受體CCR3表達下調(diào)，通過與機體內(nèi)部異常的細胞因子及細胞趨化因子相互作用，使ITP進一步極化為Th1細胞，導(dǎo)致疾病進展。

多個動物模型已證實CXCR3、CCR5、CCR3趨化因子受體可相互作用，因此，針對趨化因子受體的靶向治療有望成為自身免疫性疾病靶向治療的新方法［14，19-20］。在體外實驗的基礎(chǔ)上，課題組將進一步進行動物模型實驗，為臨床應(yīng)用針對趨化因子受體相關(guān)的靶向藥物治療ITP提供實驗依據(jù)。