劉云孫增先

(連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇連云港 222061)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種致命性心肺疾病,其病理特征是持續(xù)性肺血管收縮、血管重構(gòu)、原位血栓形成和血管周炎性浸潤等,導(dǎo)致血管腔狹窄或閉塞,引起肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)和肺動(dòng)脈壓力(pulmonary artery pressure,PAP)進(jìn)行性增加,最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡[1-3]。按病因不同將PAH分為幾個(gè)亞組,包括特發(fā)性、遺傳性、藥物和毒素誘導(dǎo)的PAH 及系統(tǒng)性硬化癥等相關(guān)形式的PAH,無論其病因如何,所有形式的PAH 都表現(xiàn)出相似的肺血管病變,具有共同的病理機(jī)制[4]。最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示特發(fā)性和遺傳性PAH 發(fā)病率為每百萬居民5 例,患病率為每百萬居民25 例,并且逐年增加趨勢明顯[5]。PAH 發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,涉及炎癥、氧化應(yīng)激和代謝轉(zhuǎn)換等機(jī)制[1,6],盡管對(duì)PAH 及其發(fā)生機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展,但目前最先進(jìn)的治療方法仍然不能靶向正在進(jìn)行的重構(gòu)過程,而是通過調(diào)控涉及維持血管張力的信號(hào)通路來治療PAH,5 年生存率只有 57%[7-9]。精確闡明 PAH 發(fā)病機(jī)制,尋找新的有效治療策略一直是臨床的迫切需求和研究熱點(diǎn),而動(dòng)物模型是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的基礎(chǔ)[10]。然而,目前還沒有一種PAH 動(dòng)物模型能夠復(fù)制PAH 的所有特征,包括血液動(dòng)力學(xué)改變和組織學(xué)重構(gòu)[11-12]。本文對(duì)PAH 動(dòng)物模型進(jìn)行回顧性總結(jié),旨在為PAH 病理機(jī)制及防治研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)載體。

1 缺氧PAH 大鼠模型

在多種動(dòng)物物種中,常采用常壓和低壓缺氧誘導(dǎo)PAH[13]。這個(gè)模型在選定的動(dòng)物品系中具有非常好的可預(yù)測性和可重復(fù)性[13]。但物種間對(duì)慢性缺氧的反應(yīng)存在差異,反應(yīng)也受到年齡等因素的影響,年輕個(gè)體更容易受到這一誘因的影響。最常用的缺氧動(dòng)物是大鼠和小鼠[12-13]。幾乎所有研究過的哺乳動(dòng)物中,缺氧誘導(dǎo)的PAH 有非常相似的結(jié)構(gòu)改變[13]。肺泡壁中正常非肌化末梢小動(dòng)脈迅速肌化,非肌化的小動(dòng)脈壁中表達(dá)α-SMA 的細(xì)胞迅速增加[13]。除了周細(xì)胞的分化和/或平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMC)“遷移”外,局部成纖維細(xì)胞募集和分化、單核細(xì)胞/祖細(xì)胞募集、內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)向間充質(zhì)樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化也可以解釋這些變化[13]。中膜SMC 顯著增殖、肥大,前毛細(xì)血管肺動(dòng)脈增厚[13]。炎癥在缺氧誘導(dǎo)的重構(gòu)過程中起著重要作用,缺氧誘導(dǎo)早期和持續(xù)期肺動(dòng)脈特異性血管炎癥反應(yīng),某些趨化因子/趨化因子受體早于炎性細(xì)胞出現(xiàn),此過程的炎性細(xì)胞主要為單核細(xì)胞。血管壁內(nèi)粘附分子和細(xì)胞因子持續(xù)存在,并伴有持續(xù)的炎癥浸潤[13]。此外,大的近端肺動(dòng)脈顯著增厚和纖維化,這些血管明顯硬化[13]。在缺氧2 周后,大鼠發(fā)生中度PAH,平均PAH 增加一倍,這似乎與結(jié)構(gòu)改變的進(jìn)展有關(guān)[13]。右心室肥大,但沒有右心衰竭的證據(jù)[13]。大鼠和小鼠對(duì)缺氧反應(yīng)存在明確的差異,小鼠的缺氧反應(yīng)有種系特異性[12-13]。恢復(fù)常氧環(huán)境可以逆轉(zhuǎn)所有動(dòng)物模型缺氧誘導(dǎo)的PAH[14-15]。在這些慢性缺氧模型中,沒有類似于人類PAH 的不可逆的內(nèi)膜纖維化或叢狀病變發(fā)生[12-13]。缺氧肺結(jié)構(gòu)改變的嚴(yán)重程度還受其他因素的影響,而不僅僅是缺氧。因此,嚙齒動(dòng)物中PAH 的慢性缺氧模型可以被認(rèn)為是不太嚴(yán)重的PAH 模型,并被視為與缺氧相關(guān)的人類PAH 相關(guān),如發(fā)生在肺實(shí)質(zhì)疾病、睡眠呼吸紊亂、嚴(yán)重慢性阻塞性肺病和高海拔居住[13,16]。炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能改變等參與了缺氧PAH 模型機(jī)制調(diào)控,涉及 Hif-1α、p38 MAPKα、NF-κB、Rho/Rho 等信號(hào)路徑[15,17-18]。

2 野百合堿PAH 大鼠模型

野百合堿(monocrotaline,MCT)是一種吡咯里西啶生物堿,存在于植物紫花野百合中[13]。MCT必須在體內(nèi)經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450 3A4 代謝成毒性代謝物MCT 吡咯(monocrotaline pyrrole,MCTP),進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)[10,13]。不同物種和種系對(duì)MCT 反應(yīng)不同,MCT 誘導(dǎo)PAH 的首選物種是大鼠,即使給予小鼠MCTP 也不能獲得預(yù)期的結(jié)果[11,13,19]。MCTP 在血漿等水溶液中快速降解(半衰期為3 ～4 s),但它可以在紅細(xì)胞中積累和轉(zhuǎn)運(yùn),保留了與肺組織相互作用的能力,這種作用導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并于數(shù)周后進(jìn)展為PAH[11,20]。MCT 與其肺毒性存在關(guān)系[11],為了提高模型的成功率,通常采用60 mg/kg 單次腹腔內(nèi)或皮下注射,3 ～ 4 周后發(fā)展為 PAH[11]。肺 EC 被認(rèn)為是 MCTP的特異性靶點(diǎn),MCTP 能與EC 膜發(fā)生特異性交聯(lián),直接導(dǎo)致EC 功能受損[21]。因此,EC 是最早發(fā)生病變的細(xì)胞。在MCT 給藥后9 ～24 h EC 發(fā)生改變,病變以EC 腫脹、胞質(zhì)囊化、胞漿不規(guī)則增厚、溶解為特征,并隨時(shí)間推進(jìn)而進(jìn)展,最終擴(kuò)展到肺血管的各級(jí)血管,其中毛細(xì)血管和小動(dòng)脈更為嚴(yán)重[22]。毛細(xì)血管膜的通透性增加,此時(shí)出現(xiàn)血小板和纖維蛋白血栓栓塞,大量的小血管管腔被部分或完全阻塞[22]。中膜改變發(fā)生在內(nèi)膜改變之后,其特征是平滑肌肥大、增生,平滑肌延伸至正常非肌化的末梢小動(dòng)脈[22]。細(xì)胞外基質(zhì)(膠原蛋白、彈力蛋白)含量增加,并與增殖的SMC 共定位[22]。外膜水腫和炎癥細(xì)胞浸潤,晚期見成纖維細(xì)胞增殖、膠原沉積、出血等[22]。在血管重構(gòu)過程中伴隨SMC 遷移、新內(nèi)膜形成、SMC 肥大和結(jié)締組織過度形成[22]。小動(dòng)脈重構(gòu)發(fā)生在中、大動(dòng)脈之前,且小動(dòng)脈中膜增厚程度要大于大動(dòng)脈[22]。此過程伴隨著PVR 和PAP 持續(xù)增加,其嚴(yán)重程度隨時(shí)間推移和MCT 劑量增加而進(jìn)展。炎癥、氧化應(yīng)激、代謝重編程等參與了MCT PAH 模型機(jī)制調(diào)控,涉及p38 MAPKα、NF-κB、PI3K/Akt/mTOR、NO 等信號(hào)路徑[11,15,23]。

MCT 誘導(dǎo)的PAH 大鼠模型能夠模擬人類PAH的幾個(gè)關(guān)鍵方面,包括血管重構(gòu)、內(nèi)皮功能障礙、SMC 增殖、炎性細(xì)胞浸潤和右心室衰竭[11]。該模型只需要單次藥物注射,且成本低廉,易于重復(fù)。其不足之處是不能模擬嚴(yán)重PAH 病理學(xué)的關(guān)鍵特征——新內(nèi)膜和叢狀病變[12-13],以及隨時(shí)間推移而PAH 可逆(4 周后),易用藥物預(yù)防或治愈[15,19]。目前臨床正在使用的三類藥物(內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、前列環(huán)素類似物)均是通過該模型進(jìn)行評(píng)估[11]。

3 基因工程PAH 動(dòng)物模型

隨著生物技術(shù)的進(jìn)展,出現(xiàn)各類基因工程PAH小鼠模型,如Egln1 敲除小鼠模型[12,24]、IL-6 過表達(dá)小鼠模型[12-13]、S100A4/Mts1 過表達(dá)小鼠模型[13]、BMPR2 突變小鼠模型[13-14]、5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體過表達(dá)小鼠模型[14]等,以及這些基因工程小鼠模型與慢性缺氧的雙擊試驗(yàn)[12,14]。這些基因工程小鼠模型為PAH 特定基因途徑的機(jī)制研究和驗(yàn)證提供了證據(jù)支持,但其整體PAH 表型與人類PAH 疾病表型還有很大差距,還不能作為 PAH 疾病研究的替代模型。

4 PAH 雙擊大鼠模型

經(jīng)典 PAH 動(dòng)物模型(缺氧誘導(dǎo) PAH 模型和MCT 誘導(dǎo)PAH 模型)為PAH 病理基礎(chǔ)研究和當(dāng)前臨床治療做出了卓越的貢獻(xiàn),尤其是MCT 誘導(dǎo)PAH 大鼠模型。隨著PAH 病理機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典動(dòng)物模型不能重現(xiàn)人類嚴(yán)重疾病的關(guān)鍵病理特征[12-13]。目前,普遍認(rèn)為PAH 的發(fā)病機(jī)制存在兩個(gè)關(guān)鍵階段,第一階段為肺動(dòng)脈非特異性中膜和外膜增厚,平滑肌向正常非肌化的小肺動(dòng)脈末梢延伸,以及異常的炎癥細(xì)胞反應(yīng);第二階段為進(jìn)行性重構(gòu)過程,導(dǎo)致中小肺動(dòng)脈新內(nèi)膜形成、叢狀動(dòng)脈病變和血管閉塞性病變,血液流動(dòng)受限。這兩個(gè)階段中的每一個(gè)階段均可導(dǎo)致嚴(yán)重的PAH、右心室肥大、失代償性右心衰竭和死亡。PAH 經(jīng)典模型的第一階段特征很明顯,然而,缺氧誘導(dǎo)的PAH 在這個(gè)階段趨于停止,并且沒有進(jìn)展到第二階段,即肺動(dòng)脈的非特異性、小動(dòng)脈明顯肌化,但是不會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜的重構(gòu)過程。此外,延長缺氧引起單核細(xì)胞和樹突狀炎癥細(xì)胞浸潤,但不會(huì)引起人類疾病中觀察到的 T 細(xì)胞浸潤。相反,MCT 誘導(dǎo)的 PAH 模型引起的肺血管重構(gòu)似乎要比缺氧誘導(dǎo)的PAH 模型嚴(yán)重些,但它仍然不能真正形成類似于在人類觀察到的嚴(yán)重叢狀動(dòng)脈病變[12-13,25]。MCT 模型誘導(dǎo)肺動(dòng)脈末梢肌化,除了復(fù)雜的炎癥反應(yīng)外,可能歸因于其廣泛的肺毒性。由此可見,經(jīng)典模型似乎只是引起PAH 的第一階段,而不是第二階段[12-13]。因此,對(duì)經(jīng)典動(dòng)物模型進(jìn)行修改已成為PAH 研究的一項(xiàng)重要工作,已開發(fā)了多種“雙擊”動(dòng)物模型,如MCT/缺氧大鼠模型、 MCT/肺切除大鼠模型、SU5416/缺氧大鼠模型,以及基因操縱/缺氧小鼠模型等等,以解決PAH 病理機(jī)制第二階段的關(guān)鍵病理特征,使之更接近于人類PAH 的病理過程。

4.1 MCT/缺氧大鼠模型

將兩個(gè)經(jīng)典模型(慢性缺氧模型和MCT 模型)組合即為MCT/缺氧大鼠模型,采用60 mg/kg 野百合堿單次注射加4 周慢性缺氧暴露誘導(dǎo),可以產(chǎn)生嚴(yán)重PAH 大鼠模型。該模型顯示血流動(dòng)力學(xué)和肺動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重改變,類似于在人類嚴(yán)重PAH中所觀察,特別是中膜嚴(yán)重肥大、新內(nèi)膜增厚、內(nèi)皮異常增殖到的病理特征、叢狀病變和血管腔閉塞與纖維蛋白血栓、血管周炎性浸潤。這些結(jié)構(gòu)性改變導(dǎo)致PVR 和PAP 顯著增加,引起更嚴(yán)重的右心室肥大和右心室收縮壓增加[16,26-27]。

4.2 MCT/肺切除術(shù)大鼠模型

MCT 另一個(gè)雙擊模型就是MCT/肺切除術(shù)大鼠模型,該模型是對(duì)大鼠實(shí)施左肺切除手術(shù)一周后,單次腹腔內(nèi)或皮下注射MCT 60 mg/kg,4 周后,引起嚴(yán)重PAH 和進(jìn)行性右心衰竭。這個(gè)模型重現(xiàn)了人類PAH 病理學(xué)的許多關(guān)鍵特征,如中、小肺血管閉塞性新內(nèi)膜形成、中膜肥大增厚、復(fù)雜叢狀病變、血管閉塞、血管周炎性增生等表型,最終導(dǎo)致嚴(yán)重PAH,右心室肥大、功能嚴(yán)重受損[13,28-29]。左肺切除導(dǎo)致肺血流量增加和紊亂,剪切應(yīng)力的劇烈改變觸發(fā)嚴(yán)重的肺血管重構(gòu),導(dǎo)致新內(nèi)膜形成和復(fù)雜叢狀病變,PAH 進(jìn)行性惡化[13,28]。在 MCT/肺切除術(shù)早期(3 周),顯示非特異性組織學(xué)改變,如中膜肥大、外膜增厚和小動(dòng)脈的肌化,但這些變化可能是可逆的。后期(6 ～8 周),產(chǎn)生新內(nèi)膜和叢狀血管病變[28]。該模型需要特殊的手術(shù)技巧,使用受到一定的限制。

4.3 SU5416/缺氧大鼠模型

Taraseviciene-Stewart 于2001 年推出一種簡練的SU5416/慢性缺氧大鼠模型,將慢性缺氧暴露與血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)酪氨酸激酶抑制劑SU5416聯(lián)合應(yīng)用,即單次注射20 mg/kg SU5416 后慢性缺氧暴露3 周,導(dǎo)致新內(nèi)膜改變的嚴(yán)重血管增生性PAH,與人類 PAH 叢狀動(dòng)脈病變類似[13,30-32]。表現(xiàn)為血管EC、SMC 過度增殖導(dǎo)致前毛細(xì)血管動(dòng)脈管腔閉合、內(nèi)皮叢狀病變形成,肺血管重構(gòu)進(jìn)行性加重,進(jìn)而導(dǎo)致右心衰竭,即使恢復(fù)常氧也不可逆[13,31,32]。而SU5416/常氧暴露大鼠僅引起輕度的PAH 和肺血管重構(gòu)[13]。該模型導(dǎo)致嚴(yán)重PAH 的機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面:一是存活信號(hào)喪失致使EC大量凋亡,導(dǎo)致凋亡抗性且表型改變的EC 出現(xiàn),這些EC 的過度增殖產(chǎn)生類似人類PAH 的叢狀動(dòng)脈病變[12,31-33]。二是通過VEGFR 非依賴性途徑上調(diào)并激活芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR),導(dǎo)致雌激素代謝產(chǎn)物增加,促進(jìn)肺動(dòng)脈EC和SMC 增殖[33]。此外,AhR 通路和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,Hif)信號(hào)傳導(dǎo)存在串?dāng)_,SU5416 增強(qiáng) AhR 核轉(zhuǎn)位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)表達(dá),ARNT(也稱為Hif1β)參與缺氧信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而增強(qiáng)慢性缺氧的促增殖作用[33]。

SU5416/慢性缺氧僅影響肺血管系統(tǒng),而不影響其他器官的脈管系統(tǒng)[31-32]。SU5416 半衰期僅為30 min,在體內(nèi)被快速清除,在主要器官及肺中沒有積累。但SU5416 卻具有長效抑制活性,這是由于SU5416 與EC 膜具有特異的親合力,優(yōu)先在EC 膜濃縮富集,然后再將SU5416 緩慢釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),并長時(shí)間保持 SU5416 對(duì) VEGFR 的抑制作用[31]。內(nèi)皮細(xì)胞生存信號(hào)喪失、氧化應(yīng)激等參與了SU5416/缺氧 PAH 模型機(jī)制調(diào)控,涉及 VEGFR、TGF-β/BMP/Smad、 Hif-1α、 MAPK、 AhR 等 信 號(hào)路徑[30,32-33]。

在SU5416/缺氧大鼠模型基礎(chǔ)上發(fā)展的SU5416/缺氧/常氧大鼠模型,即單次注射20 mg/kg SU5416 和 3 周慢性缺氧后,恢復(fù)常氧 10 ～ 11周[12,28,31]。該模型除了由SU5416/缺氧驅(qū)動(dòng)的嚴(yán)重PAH 表型外,復(fù)氧10 周導(dǎo)致嚴(yán)重叢狀動(dòng)脈病變形成,不僅重現(xiàn)了人類PAH 疾病中所見的第一階段,而且重現(xiàn)了第二階段。在這個(gè)大鼠模型中,三種類型的叢狀動(dòng)脈病變都被重建,即同心層狀新內(nèi)膜、莖樣和動(dòng)脈瘤樣復(fù)雜病變,這三種類型的復(fù)雜病變與人類晚期PAH 發(fā)展的嚴(yán)重叢狀動(dòng)脈病變極為相似,同時(shí)PAH 和右心室肥大顯著增加[12]。這種大鼠模型成為PAH 動(dòng)物模型開發(fā)的標(biāo)桿之作。

4.4 其他PAH 雙擊模型

其他PAH 雙擊模型,如MCT/主動(dòng)脈分流大鼠模型[34]、左肺切除/SU5416 大鼠模型[28]、SU5416/缺氧小鼠模型[30,32,35]、IL-6Tg+/缺氧小鼠模型[12]以及其他基因操縱/缺氧小鼠模型等,成模效果不如上面介紹的雙擊模型,實(shí)踐中應(yīng)用不多,不代表PAH 研究的主流實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

5 結(jié)語

PAH 是一種多病因、進(jìn)行性、機(jī)制復(fù)雜的人類疾病,血管重構(gòu)是其關(guān)鍵病理特征,開發(fā)能夠重現(xiàn)人類PAH 所有特征的動(dòng)物模型將為PAH 病理生理機(jī)制研究和新的防治策略評(píng)價(jià)提供重要支撐。目前已開發(fā)的PAH 動(dòng)物模型均有一定的局限性,如經(jīng)典PAH 動(dòng)物模型(缺氧模型和MCT 模型)不能再現(xiàn)人類疾病的嚴(yán)重病理學(xué)特征(新內(nèi)膜和叢狀病變),而雙擊模型可以概括人類 PAH 更多的病理特征——進(jìn)行性、不可逆的肺血管重構(gòu),重述嚴(yán)重的PAH 病理特征。SU5416/缺氧模型可重現(xiàn) PAH 晚期復(fù)雜的叢狀病變,但不能重現(xiàn)血栓性病變。其他雙擊模型只重現(xiàn)PAH 早期的叢狀病變,MCT 雙擊模型還可呈現(xiàn)血栓性病變和炎癥病變。因此,開發(fā)簡便易行,能夠重現(xiàn)人類PAH 病理生理特征的動(dòng)物模型仍是努力方向。在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究目的選擇最合適的動(dòng)物模型,推薦使用一種以上的PAH 動(dòng)物模型。