蘇丹美，李 娟，郭先林，何興金，周頌東

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064)

匍莖百合(Liliumlankongense)隸屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)，是中國(guó)的一個(gè)特有百合物種，主要分布于西藏東南部、云南西北部等地，多年生草本植物，花被片反卷，花粉紅色且有深紅色斑點(diǎn)[1]。匍莖百合不僅具有花型優(yōu)美，具芳香味等較高的觀賞價(jià)值，而且由于對(duì)亞洲百合雜種系最重要的疾病——葡萄孢疫病具有高度的抗性，被認(rèn)為是百合園藝品種雜交育種的良好材料[2-5]。近年來，對(duì)于匍莖百合的研究主要集中在個(gè)別居群的花粉、葉表皮形態(tài)、核型和分子系統(tǒng)學(xué)[6-10]等方面。

細(xì)胞地理學(xué)是一門研究染色體的特性及其與植物地理分布之間關(guān)系的學(xué)科[11]。染色體作為基因的載體，在植物地理分布中具有特殊的重要性，因此細(xì)胞地理學(xué)也被稱作染色體地理學(xué)[12]。核型是體細(xì)胞染色體數(shù)目、大小、形狀和縊痕相對(duì)位置等形態(tài)結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)[13]，在同一物種不同自然居群間和近緣物種間，可能存在差異，從而導(dǎo)致物種變異或進(jìn)化。因此，核型可作為推測(cè)物種進(jìn)化途徑、擴(kuò)散路線和親緣關(guān)系的細(xì)胞學(xué)依據(jù)[14-16]，在細(xì)胞地理學(xué)研究中具有特殊意義[13]。已有許多學(xué)者借助種內(nèi)不同居群的核型探討了物種的種類分化等問題，如長(zhǎng)花馬先蒿、康滇假合頭菊、瀘定百合、七筋姑和玉竹[17-21]等，而匍莖百合大多數(shù)居群仍缺乏細(xì)胞學(xué)資料。本研究在匍莖百合各個(gè)分布區(qū)收集了代表居群8個(gè)并希望結(jié)合前人報(bào)道，對(duì)匍莖百合核型數(shù)據(jù)分析，從細(xì)胞地理學(xué)方面揭示匍莖百合種內(nèi)演化趨勢(shì)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

基于匍莖百合的標(biāo)本記錄，于2018 ～ 2019年在西藏自治區(qū)、云南省和四川省野外共收集了匍莖百合8個(gè)居群的實(shí)驗(yàn)材料。匍莖百合狹域分布于橫斷山區(qū)，在西藏自治區(qū)、四川省分別收集了1個(gè)居群，在云南省共收集了6個(gè)居群。將各居群個(gè)體鱗莖分別保存并移栽到花盆中，置于本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)室。材料來源及憑證標(biāo)本保存于四川大學(xué)植物標(biāo)本館SZ(表1)。

表1 匍莖百合8個(gè)居群的細(xì)胞學(xué)材料來源

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

待野外采回的鱗莖根尖長(zhǎng)至2 ～ 3 cm時(shí)，取幼嫩根尖作為實(shí)驗(yàn)材料。具體做法如下：1)上午8：00 ～ 9：00切取根尖1 ～ 2 cm，加入0.1%秋水仙素水溶液與飽和對(duì)二氯苯水溶液1∶1混合液于黑暗環(huán)境中預(yù)處理9 ～ 11 h；2)置于現(xiàn)配的卡諾氏固定液(冰乙酸∶無水乙醇=1∶3)中于4 ℃冰箱中固定過夜；3)轉(zhuǎn)入至70%乙醇中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?)1 mol/L鹽酸(60 ℃恒溫水浴)解離12 ～ 15 min；5)改良苯酚品紅染液靜置染色12 min；6)常規(guī)壓片，鏡檢。選擇分裂相良好的中期細(xì)胞在100倍油鏡下拍照。染色體計(jì)數(shù)按Levan等[22]方法。每個(gè)居群至少取5個(gè)分散較好的細(xì)胞染色體測(cè)量其核型參數(shù)。隨體計(jì)算在染色體長(zhǎng)度之內(nèi)，以一個(gè)居群內(nèi)觀察到的最高隨體數(shù)目作為該居群隨體個(gè)數(shù)[23]。核型分析和命名采用Levan等[22]方法，核型不對(duì)稱性采用Stebbins[24]處理方式。此外，也用Arano[25]提出的不對(duì)稱系數(shù)As.K%來評(píng)估核型不對(duì)稱性，As.K%值越高，核型越不對(duì)稱。核型數(shù)據(jù)測(cè)量和處理采用軟件MAML 1.0[26]并輔之以手動(dòng)調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

在本研究中，匍莖百合察隅居群、書松村居群、茨中村居群、蘭坪居群、維西居群、木里居群核型為首次報(bào)道，首次發(fā)現(xiàn)匍莖百合中存在B染色體。匍莖百合細(xì)胞核型比較結(jié)果見表2，隨體染色體(satellite chromosome)在核型公式中簡(jiǎn)寫為SAT。各居群染色體形態(tài)和核型圖見圖版Ⅰ和圖版Ⅱ、核型模式圖見圖版Ⅲ。

圖版Ⅰ 匍莖百合不同居群染色體形態(tài)和核型圖A、A′. 察隅居群；B、B′. 茨中村居群；C、C′.書松村居群；D、D′. 貢山居群。箭頭所指表示次縊痕位置，標(biāo)尺長(zhǎng)度10 μmPlate Ⅰ Morphology and karyotype of somatic chromosomes of L. lankongense in different populationsA,A′. Zayü population; B,B′. Cizhong population; C,C′. Shusong population; D,D′. Gongshan population. Black arrows show the secondary constrictions. Scale bar indicating 10 μm

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8個(gè)居群的染色體基數(shù)均為x = 12，為二倍體，染色體數(shù)目為2n = 2x = 24(表2)。染色體類型包含m、sm、st和t等4種，核型均屬于Stebbins[24]的3B型。不對(duì)稱系數(shù)As.K%介于81.28% ～ 83.53%，差異較小，察隅居群為最低，木里居群為最高，核型不對(duì)稱性強(qiáng)。除了書松村居群臂比值大于2的染色體占全部染色體數(shù)的百分比為87.50%外，其他7個(gè)居群的百分比均為83.33%。察隅居群、茨中村居群、書松村居群、貢山居群、蘭坪居群、麗江居群、維西居群、木里居群的最長(zhǎng)與最短染色體相對(duì)長(zhǎng)度比值分別為2.18、2.31、2.27、2.18、2.18、2.18、2.19以及2.22，可見除了茨中村居群、書松村居群、木里居群數(shù)值稍大外，其他居群最長(zhǎng)與最短染色體相對(duì)長(zhǎng)度比值都接近。8個(gè)居群中，2個(gè)居群(木里居群和書松村居群)有B染色體；5個(gè)居群(察隅居群、茨中村居群、蘭坪居群、維西居群、麗江居群)有隨體，包括居間隨體、短臂隨體和長(zhǎng)臂隨體，隨體數(shù)目為1 ～ 3(表2，圖版 Ⅲ)。

從核型公式來看(表2)，匍莖百合8個(gè)居群的染色體組成可以分為兩大類：一是染色體類型只包括m、st和t三種，如察隅居群、茨中村居群和木里居群；二是染色體包含m、sm、st和t四種類型，如書松村居群、貢山居群、蘭坪居群、麗江居群、維西居群。具備第一類(沒有sm染色體)組成核型的3個(gè)居群，其地理分布點(diǎn)幾乎位于同一弧線上(圖1)，并且第1對(duì)和第2對(duì)染色體類型均是m。染色體類型多樣性呈現(xiàn)出察隅居群、茨中村居群和木里居群這一弧線居群小于這一弧線上緯度向南、向北。

如表2所示，不對(duì)稱系數(shù)As.K%從小到大排列為：察隅居群(81.28%)、麗江居群(82.07%)、茨中村居群(82.16%)、蘭坪居群(82.25%)、維西居群(82.33%)、貢山居群(82.38%)、書松村居群(82.77%)，木里居群(83.53%)，核型不對(duì)稱系數(shù)整體上表現(xiàn)為從西到東遞增。如表2，圖版 Ⅲ所示，第3對(duì)和第10對(duì)染色體上多具有隨體。在核型的隨體特征方面，察隅縣居群在第1對(duì)和第10對(duì)染色體分別有1條具有短臂隨體和長(zhǎng)臂隨體；茨中村居群和維西居群第3對(duì)具有居間隨體，第10對(duì)染色體有1條具有長(zhǎng)臂隨體；蘭坪居群第3對(duì)染色體具有居間隨體，第10對(duì)染色體其中1條有居間隨體；麗江居群第3對(duì)和第10對(duì)染色體各有1條居間隨體。不同居群間隨體數(shù)量和位置存在差異，隨著從西到東的地理分布，居間隨體增加，隨體數(shù)量增加。

圖版Ⅲ 匍莖百合8個(gè)居群的核型模式圖A. 察隅居群；B. 茨中村居群；C.書松村居群；D.貢山居群；E.蘭坪居群；F.麗江居群；G.維西居群；H.木里居群Plate Ⅲ Idiograms of 8 populations of L. lankongenseA. Zayü population; B. Cizhong population; C. Shusong population; D. Gongshan population; E.Lanping population; F. Lijiang population; G. Weixi population; H. Muli population

表2 匍莖百合8居群核型參數(shù)比較

從染色體類型、核型不對(duì)稱系數(shù)以及隨體類型分析，匍莖百合核型整體表現(xiàn)為察隅縣-茨中村-木里縣這一條線縣居群染色體類型多樣性小于這一條線上向北、向南分布居群染色體多樣性，從西到東地理居群核型不對(duì)稱系數(shù)以及隨體類型呈現(xiàn)出由西向東增強(qiáng)趨勢(shì)，匍莖百合可能的擴(kuò)散方式如圖1所示。

箭頭表示匍莖百合可能的擴(kuò)散方向

3 討 論

周頌東[7]于2008年報(bào)道了匍莖百合云南香格里拉納帕草原居群(以下簡(jiǎn)稱：納帕草原居群)，核型公式為2n=2x=24=4m+10st(6SAT)+10t，核型不對(duì)稱系數(shù)為80%，最長(zhǎng)染色體/最短染色體比例為1.96，臂比大于2的染色體比例為83%，核型類型為3A型，第3、6和9對(duì)染色體都具有隨體。本研究采集的8個(gè)居群和周頌東報(bào)道的納帕草原居群(共9個(gè)居群，分布點(diǎn)見圖1)幾乎涵蓋了匍莖百合所有的分布點(diǎn)，能基本反映匍莖百合染色體特性與地理分布之間的聯(lián)系。

百合族的核型同源染色體的雜合性主要是由于染色體的結(jié)構(gòu)變異。染色體結(jié)構(gòu)變異包括染色體的不等長(zhǎng)易位、缺失，以及染色體非相互易位、臂間或臂內(nèi)倒位，前者可引起同源染色體長(zhǎng)度不等，后者可引起同源染色體長(zhǎng)度、類型和次縊痕差異[7]。在本研究中匍莖百合的同源染色體表現(xiàn)出長(zhǎng)度不等，配對(duì)差，有無次縊痕，或是組成同源染色體的染色體類型不同等結(jié)構(gòu)變異，這些變異現(xiàn)象在百合族植物中都有發(fā)現(xiàn)[7]。染色體的結(jié)構(gòu)變異是百合屬種內(nèi)分化的基礎(chǔ)，外部表現(xiàn)形式為次縊痕。次縊痕的進(jìn)化趨勢(shì)如下：細(xì)胞核型中無次縊痕的種類是較原始的，具次縊痕和次縊痕多的種類是進(jìn)化的；端部隨體較居間隨體原始[7]。匍莖百合的納帕草原居群的第3對(duì)、第6對(duì)、第9對(duì)具有較進(jìn)化的居間隨體[8]，在隨體的數(shù)量和類型上納帕草原居群也符合表2中8個(gè)居群呈現(xiàn)出的隨著從西到東的地理分布，隨體數(shù)量增加，居間隨體增加。因此從隨體方面，匍莖百合在核型上(即不同居群的隨體染色體不同)染色體表現(xiàn)出自西到東演化的趨勢(shì)。

染色體核型不對(duì)稱是細(xì)胞地理學(xué)研究中的重要量化指標(biāo)[17]，但Paszko[27]認(rèn)為僅用Stebbins提出的核型不對(duì)稱性是很難準(zhǔn)確反映染色體的不對(duì)稱性。本研究結(jié)合核型類型和Arano[25]提出的核型不對(duì)稱系數(shù)，基于3項(xiàng)原則(百合族核型的演化由3A←3B→3C[7]；染色體核型由對(duì)稱性向不對(duì)稱性演化[28]；核型不對(duì)稱系數(shù)值越高，核型越不對(duì)稱[25])分析納帕草原居群的染色體的不對(duì)稱性。納帕草原居群[8]的核型不對(duì)稱系數(shù)偏低，但核型為3A型，隨體數(shù)量和類型多，因此認(rèn)為納帕草原居群是較為進(jìn)化的居群。

此外，從核型的類型來看，匍莖百合的核型類型可以分為兩類，類型1的染色體組成只有m、st和t三種，如察隅縣-茨中村縣-木里縣這一弧線上的4個(gè)居群(納帕草原居群、察隅居群、茨中村居群、木里居群)。類型2的染色體組成有m、sm、st和t四種，多了sm染色體，存在于其他的5個(gè)居群。類型1的第一對(duì)和第二對(duì)染色體均為m，第二對(duì)染色體的形態(tài)并不完全一致，其中一條的染色體著絲粒較另一條更靠近中部，短臂長(zhǎng)度有些許差異。而類型2的第二對(duì)染色體著絲粒位置較為接近，為近中部著絲粒。Stebbins[24]認(rèn)為m染色體向sm染色體的進(jìn)化時(shí)，至少要發(fā)生染色間不等羅伯遜易位、同一染色體臂間不等倒位或染色體內(nèi)轉(zhuǎn)化，這是染色體結(jié)構(gòu)變異的表現(xiàn)。因此類型1的第二對(duì)m染色體間短臂染色體可能發(fā)生不等羅伯遜易位，進(jìn)化為類型2的sm染色體，可以推測(cè)察隅居群、茨中村居群、納帕草原居群和木里居群這一條線上與從這一條水平線上分別向北和南方向的居群相比，更為原始。綜合次縊痕、核型不對(duì)稱系數(shù)和染色體組成等數(shù)據(jù)，揭示了匍莖百合各居群在地理分布上沿著察隅縣-茨中村-香格里拉市-木里縣這一條線從西到東的遷移、擴(kuò)散的分布過程中，其對(duì)應(yīng)分布的地理居群的核型也呈現(xiàn)出由西向東的不對(duì)稱性增強(qiáng)、由相對(duì)原始到相對(duì)進(jìn)化的演化趨勢(shì)。同時(shí)分布于貢山縣至香格里拉市一線的居群在地理分布上還存在緯度上的向北和向南遷移、擴(kuò)散的分布擴(kuò)張態(tài)勢(shì)，其對(duì)應(yīng)分布的地理居群的核型呈現(xiàn)出由貢山縣至香格里拉市一線向北和向南分布的居群核型不對(duì)稱性增加、由相對(duì)原始至相對(duì)進(jìn)化的演化趨勢(shì)(圖1)。

在匍莖百合的9個(gè)居群中，只在書松村居群和木里居群中發(fā)現(xiàn)B染色體。B染色體的存在有利于個(gè)體和居群在極端條件下存活[29]。書松村居群和木里居群的生境是樹林邊緣的峭壁上，與其他居群的松樹林下和草坡相比，環(huán)境相對(duì)惡劣，并且周圍環(huán)境能發(fā)現(xiàn)的個(gè)體較少，不似其他居群的個(gè)體繁多。因此，B染色體雖然不能作為種級(jí)和種下等級(jí)的劃分依據(jù)，但對(duì)特殊環(huán)境的適應(yīng)方面具有十分重要的意義，可以為匍莖百合向外擴(kuò)大生存空間時(shí)，克服特殊生境帶來的向外擴(kuò)張方面的環(huán)境因子障礙，這充分表明特產(chǎn)中國(guó)青藏高原的匍莖百合是一個(gè)正處于高度分化過程中的物種。