于 婷,孫 楠,孫 晶,楊 振,黃 杰

中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所，北京 100050

謬?yán)展芤种扑匾卜Q抗謬?yán)展芗に?AMH)，因其可引起雄性胎兒的苗勒管退化而得名，是一種由男性睪丸支持細(xì)胞和女性卵泡顆粒細(xì)胞分泌的二聚體糖蛋白，在胚胎的性別分化中參與早期性器官定向分化[1-2]。AMH可抑制女性卵泡細(xì)胞的生長，調(diào)節(jié)男性睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能。血清中AMH水平可用于評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能，輔助診治相關(guān)疾病如卵巢功能早衰、性別發(fā)育異常等[3-5]，臨床上主要用于輔助生殖技術(shù)等[6-8]。

世界衛(wèi)生組織(WHO)生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)在2015年已認(rèn)識(shí)到有必要制定AMH的國際標(biāo)準(zhǔn)(IS)，用于校準(zhǔn)人血清和血漿中AMH免疫分析測(cè)定。因此，英國生物制品檢定所(NIBSC)采用捐贈(zèng)的人重組AMH，制備了編號(hào)為16/190的AMH國際標(biāo)準(zhǔn)品候選品。并在2018年開展了協(xié)作標(biāo)定，目標(biāo)是：(1)用各自方法校準(zhǔn)的不同免疫分析方法測(cè)定16/190中AMH水平；(2)評(píng)價(jià)16/190用于AMH免疫分析校準(zhǔn)的適用性；(3)評(píng)價(jià)16/190經(jīng)熱加速降解后的穩(wěn)定性。中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室代表中國實(shí)驗(yàn)室應(yīng)邀參加了本次國際協(xié)作標(biāo)定研究，全球共有4個(gè)國家7個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 AMH國際候選品：編號(hào)分別為16/190、A、C、D～H，為編號(hào)不同的同一標(biāo)本，0.5 mL溶液凍干后殘余物，內(nèi)容物包括1.2 mg牛酪蛋白，2.5 mg海藻糖和理論上500 ng重組人AMH。編號(hào)為16/190的安瓿標(biāo)本，為預(yù)實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本，目的是先確認(rèn)各試劑對(duì)其的反應(yīng)性，以便在正式實(shí)驗(yàn)前可以找到合適的線性范圍。編號(hào)A和C的安瓿標(biāo)本，為正常保存狀態(tài)標(biāo)本，互為復(fù)管，平行測(cè)定用。D～H為熱加速標(biāo)本，分別保存于4、45、37、20和-20 ℃條件下21個(gè)月13天。

AMH國際候選品的比較標(biāo)本：編號(hào)為B，內(nèi)容物約為候選品的50%。

17份人血清標(biāo)本(編號(hào)為AMHSerum1～AMHSerum17)：每份0.6～0.8 mL，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法確定AMH水平在0.9～17.0 ng/mL范圍內(nèi)。5份編號(hào)為AMHPlasma18～AMHPlasma22人血漿標(biāo)本，每份標(biāo)本為0.6～0.8 mL，經(jīng)ELISA確定AMH水平在<0.1～12.0 ng/mL范圍內(nèi)。4份標(biāo)本濃度超過10 ng/mL。這些標(biāo)本編號(hào)分別為：5、9、16和22。因此，線性范圍≤10 ng/mL的試劑盒在檢測(cè)前應(yīng)采用標(biāo)本稀釋液進(jìn)行1∶1稀釋。血清/血漿樣品來自英國First Link公司、英國TCS生物科學(xué)公司或法國CERBA標(biāo)本公司。一些標(biāo)本為絕經(jīng)后人血清稀釋得到。來自英國First Link公司和美國TCS生物科學(xué)公司的血樣已檢測(cè)HIV 1和2、HIV p24、HBsAg、抗-HCV和梅毒螺旋體抗體，結(jié)果均為陰性。來自法國CERBA標(biāo)本公司的標(biāo)本為臨床剩余標(biāo)本，經(jīng)NIBSC檢測(cè)，HBsAg、HIV抗體和HCV RNA均為陰性。

NIBSC根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的分析能力和可提供的標(biāo)本數(shù)量分配標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)室得到的標(biāo)本為：16/190(A、B、C)、17份血清標(biāo)本和5份血漿標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 本次國際協(xié)作標(biāo)定用的試劑盒，包括10種化學(xué)發(fā)光法(含電化學(xué)發(fā)光、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光等)、兩種酶聯(lián)免疫法(含酶聯(lián)免疫熒光法)和1種免疫熒光層析法試劑盒，共計(jì)13種，分別是：抗繆勒氏管激素測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)、抗繆勒氏管激素測(cè)定試劑盒(免疫熒光層析法)和抗繆勒氏管激素測(cè)定試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，以上3種均由深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司提供；AMH檢測(cè)試劑盒(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法)，泰州澤成生物技術(shù)有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(酶聯(lián)免疫熒光法)，梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；AMH檢測(cè)試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)，貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司；AMH檢測(cè)試劑盒(磁微粒化學(xué)發(fā)光法)，鄭州安圖生物工程股份有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)，廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)，深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光免疫分析法)，上海透景生命科技股份有限公司；AMH測(cè)定試劑盒(磁微粒化學(xué)發(fā)光法)，北京利德曼生化股份有限公司。

1.3WHO研究方案 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：(1)收樣后，應(yīng)放置于-20 ℃或以下保存；(2)AMH候選品各編號(hào)標(biāo)本及B標(biāo)本，使用前均應(yīng)平衡至室溫，以減少水分吸收；血清標(biāo)本使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫，等其內(nèi)容物徹底融化，并應(yīng)充分輕柔混勻；血漿標(biāo)本使用前應(yīng)在37 ℃水浴中放置6 min融化，1 500 r/min(250×g)離心10 min，取上清備用；(3)AMH候選品各編號(hào)標(biāo)本及B標(biāo)本均采用1.0 mL去離子水充分溶解得到儲(chǔ)備液，進(jìn)一步的配制應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行。緩沖液應(yīng)含有一定量的蛋白以防止表面吸附，通常為0.1%(w/v)牛血清清蛋白或0.1%(w/v)人血清清蛋白。如果在后續(xù)的分析中不能使用新鮮開封的AMH國際標(biāo)準(zhǔn)品或候選品，建議將儲(chǔ)備液分裝，并置于-20 ℃及以下保存；(4)為更好地比較不同免疫學(xué)分析方法，需要所有參加實(shí)驗(yàn)室在各自試劑盒的線性范圍內(nèi)，且配制AMH候選品各編號(hào)標(biāo)本及B標(biāo)本的濃度應(yīng)盡量保持一致(16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250和0.125 ng/mL)，如線性范圍不能滿足要求，則應(yīng)至少包含上述中的5種濃度，每種濃度標(biāo)本至少3次重復(fù)(采用96孔板檢測(cè)的試劑可僅重復(fù)兩次)；(5)每種方法至少進(jìn)行兩次獨(dú)立分析，每次分析均應(yīng)包含分配的所有樣品、稀釋液及試劑盒校準(zhǔn)品。

1.4方法 本次國際協(xié)作標(biāo)定嚴(yán)格按照WHO的要求進(jìn)行。按照各試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)分析。

預(yù)實(shí)驗(yàn)：僅分析16/190，先確認(rèn)各試劑對(duì)其的反應(yīng)性，以便在正式實(shí)驗(yàn)前找到合適的線性范圍。正式實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)A、B、C、17份血清標(biāo)本和5份血漿標(biāo)本。

標(biāo)本復(fù)溶與系列溶液配制：16/190、A、B和C均采用1 mL去離子水充分溶解，16/190、A和C均得到500 ng/mL的儲(chǔ)備液，B得到約250 ng/mL的儲(chǔ)備液。進(jìn)一步稀釋采用各試劑盒專用稀釋液，在各試劑盒的線性范圍內(nèi)，按照要求進(jìn)行配制。血清和血漿按照WHO方案進(jìn)行處理。

劑量-反應(yīng)曲線的建立：預(yù)實(shí)驗(yàn)中，僅包括16/190及試劑盒校準(zhǔn)品2條劑量-反應(yīng)曲線；正式實(shí)驗(yàn)中，包括A、B、C及試劑盒校準(zhǔn)品各1條劑量-反應(yīng)曲線。每條曲線含7～8種濃度，每種濃度及稀釋液重復(fù)測(cè)定2～3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以參加實(shí)驗(yàn)室上報(bào)的AMH濃度進(jìn)行分析。為確定是否具有可接受的稀釋線性，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，如果log10(測(cè)定濃度)與log10(理論濃度)的擬合回歸線性的斜率在0.91～1.10內(nèi)，且r2>0.975，實(shí)驗(yàn)有效。此外，只有當(dāng)2個(gè)重復(fù)標(biāo)本(A、C)測(cè)定值的比值在0.91～1.10范圍內(nèi)，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。對(duì)所有有效結(jié)果采用稀釋因子校正后，得到各實(shí)驗(yàn)室的未加權(quán)幾何均值(GM)，合并這些結(jié)果計(jì)算整體未加權(quán)GM。實(shí)驗(yàn)室間變異采用GM均數(shù)變異系數(shù)(GCV)表示[GCV=(10s-1)×100%，s是log10轉(zhuǎn)換值的標(biāo)準(zhǔn)差]。由于可能出現(xiàn)離群值和異常結(jié)果，同時(shí)采用了R的package“WRS2”計(jì)算穩(wěn)健均值。

2 結(jié) 果

2.1候選品結(jié)果 按照WHO方案中的數(shù)據(jù)處理原則，以各試劑盒校準(zhǔn)品曲線計(jì)算得到的16/190濃度，結(jié)果見表1。本實(shí)驗(yàn)室提交的13套數(shù)據(jù)中，按照WHO的數(shù)據(jù)處理原則，方法1、4、10和11不滿足擬合回歸線性斜率在0.90～1.11內(nèi)，方法3不滿足A與C的比值在0.91～1.10內(nèi)，最終有效數(shù)據(jù)8套。將無效數(shù)據(jù)剔除后進(jìn)行匯總分析，A和C結(jié)果合并后得到，濃度GM為448 ng·安瓿-1(95%CI:377～531 ng·安瓿-1，n=8，GCV=23%)，WHO的結(jié)果為511 ng·安瓿-1(95%CI:426～612 ng·安瓿-1，n=16，GCV=42%)，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值與WHO測(cè)定值的相對(duì)偏差為-12%。B的結(jié)果為濃度幾何均值為246 ng·安瓿-1(95%CI:196～310 ng·安瓿-1，n=8，GCV=32%)，WHO結(jié)果為269 ng·安瓿-1(95%CI:221～328 ng·安瓿-1，n=16，GCV=45%)，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值與WHO測(cè)定值的相對(duì)偏差為-7.8%。B的預(yù)期濃度約為A或C的一半，本實(shí)驗(yàn)室得到的比值為0.55(95%CI:0.50～0.61，n=8，GCV=13%)，實(shí)際結(jié)果與預(yù)期結(jié)果基本一致，表明在一種方法中，對(duì)AMH的識(shí)別是一致的。WHO結(jié)果為0.53(95%CI:0.50～0.56，n=16，GCV=12%)，本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值與WHO測(cè)定值的相對(duì)偏差為3.8%。

表1 安瓿A、B、C中AMH濃度、A和C的GM及B/(A和C的GM)

2.2血清及血漿標(biāo)本結(jié)果 NIBSC共提供17份血清標(biāo)本及5份血漿標(biāo)本，本實(shí)驗(yàn)室結(jié)果見表2。本實(shí)驗(yàn)室共提交13套數(shù)據(jù)，每套數(shù)據(jù)中兩組平行測(cè)定結(jié)果。其中1套數(shù)據(jù)與其他結(jié)果差異較大，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后剔除。

從結(jié)果可以看出，除低值標(biāo)本(AMHPlasma18)外，其他21份血清或血漿標(biāo)本，各家測(cè)值差異整體來說比候選品的差異稍小，但均超過10.0%，CV在12.3%～28.9%內(nèi)，GCV均值為17.4%(95%CI:15.7%～19.2%)。因18號(hào)血漿標(biāo)本濃度接近零值，22號(hào)標(biāo)本濃度超出多家檢測(cè)試劑盒線性范圍，WHO總結(jié)數(shù)據(jù)中，剔除這兩個(gè)標(biāo)本的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值與WHO測(cè)定值的相對(duì)偏差在-7.3%～11.5%內(nèi)。

表2 AMH血清及血漿標(biāo)本的GM及與WHO測(cè)定結(jié)果的比較

最終，4個(gè)國家7個(gè)實(shí)驗(yàn)室共同完成了本次協(xié)作標(biāo)定。本實(shí)驗(yàn)室提供了13套檢測(cè)數(shù)據(jù)，占總提交數(shù)據(jù)(21套)的61.9%，其中8套數(shù)據(jù)被WHO采納，占全部有效數(shù)據(jù)(16套)的50.0%。經(jīng)WHO統(tǒng)計(jì)匯總分析，16/190的濃度GM為511 ng·安瓿-1(95%CI:426～612 ng·安瓿-1，n=16，GCV=42%)，穩(wěn)健均值為489 ng·安瓿-1，且穩(wěn)定性均滿足要求。但因16/190與患者標(biāo)本在多個(gè)方法中不具互換性，經(jīng)NIBSC提議，WHO生物標(biāo)準(zhǔn)專家委員會(huì)審核批準(zhǔn)，16/190為AMH第1次國際參考試劑，濃度為489 ng·安瓿-1。

3 討 論

AMH分子由兩個(gè)通過二硫鍵連接的相同糖基化亞基組成，每個(gè)亞基都可裂解形成N-端和C-端二硫鍵合的二聚體，二聚體保持非共價(jià)結(jié)合。有報(bào)道稱，可以從血清中分離出裂解和未裂解的AMH[9]。目前臨床上使用的免疫分析中，所使用的抗體識(shí)別的多是總AMH。

候選品原料來自美國馬薩諸塞州總醫(yī)院兒科外科研究實(shí)驗(yàn)室捐贈(zèng)給NIBSC的重組AMH，從穩(wěn)定CHO細(xì)胞株LR-MIS的培養(yǎng)基中純化得到。該重組AMH表達(dá)來自人血清清蛋白(HSA)具有前導(dǎo)序列的人AMH序列，在氨基酸423-428的內(nèi)部裂解位點(diǎn)有修飾，從RAQR/S轉(zhuǎn)變成RARR/S[10]，HSA前導(dǎo)序列在成熟過程中被裂解。NIBSC在2016年以該原料制備了編號(hào)為16/190的AMH國際候選標(biāo)準(zhǔn)品。目前的AMH免疫分析結(jié)果以質(zhì)量單位(ng/mL)或摩爾單位(pmol)為單位，使用轉(zhuǎn)換因子1 ng/mL=7.14 pmol/L，這是基于聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的糖基化二聚體的表觀分子量[11-12]。但AMH質(zhì)量單位的可追溯性并不清楚，所以尚未建立AMH參考方法。

本次AMH國際協(xié)作標(biāo)定共有4個(gè)國家7個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加，采用了21種方法。本實(shí)驗(yàn)室采用了13種方法，10家國產(chǎn)試劑和3家進(jìn)口試劑，基本涵蓋在我國開展AMH檢測(cè)的所有原理的試劑盒，其中以化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒為主，這是目前的主流方法，也是國際上的主流方法，以上結(jié)果表明本研究數(shù)據(jù)具有非常好的代表性，本實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果為WHO評(píng)價(jià)16/190作為第1次AMH國際參考試劑提供了豐富、可靠的數(shù)據(jù)。

由于目前AMH檢測(cè)無參考方法，亦無上一代國際標(biāo)準(zhǔn)品，所以NIBSC采用了各AMH試劑盒直接測(cè)定值進(jìn)行聯(lián)合定值，以全部結(jié)果的穩(wěn)健均值作為最終結(jié)果。在剔除不滿足要求的數(shù)據(jù)后，本實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果為：448 ng·安瓿-1(95%CI：377～531，n=8，GCV=23%)，16/190實(shí)測(cè)值的最低值僅為283 ng·安瓿-1，最高值達(dá)到556 ng·安瓿-1，最低值與最高值之間相對(duì)偏差達(dá)到49%。而在WHO報(bào)告中，全部實(shí)驗(yàn)室AMH國際候選標(biāo)準(zhǔn)品的免疫效價(jià)匯總結(jié)果在282～1 157 ng·安瓿-1內(nèi)，GCV達(dá)到42%。這些結(jié)果表明了目前各AMH檢測(cè)試劑盒之間測(cè)定結(jié)果的一致化程度并不是很好。其原因可能因?yàn)橹亟MAMH和天然AMH在分子構(gòu)成、構(gòu)型等方面存在差異，而且各家包被的抗體來源不一定相同，識(shí)別AMH抗原位點(diǎn)不一致，均可導(dǎo)致抗原抗體間反應(yīng)性不一致；另一方面，緩沖體系與真實(shí)標(biāo)本血清基質(zhì)存在差異，即基質(zhì)效應(yīng)也可造成測(cè)值結(jié)果不一致等；此外，還與各測(cè)定原理和技術(shù)的不同、數(shù)據(jù)處理的曲線擬合方式差異有關(guān)等。

除定值結(jié)果不理想外，WHO提供的互換性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅6種方法中的16/190和標(biāo)本具有互換性，3種方法具有部分互換性，7種方法無互換性。以上結(jié)果表明，如果將16/190定為國際標(biāo)準(zhǔn)品，既無溯源依據(jù)支持，亦無實(shí)際數(shù)據(jù)支持，實(shí)際應(yīng)用中必然存在一定爭議。鑒于上述因素，NIBSC不建議將16/190作為人重組AMH的國際標(biāo)準(zhǔn)品，但是為了進(jìn)一步促進(jìn)AMH校準(zhǔn)和免疫學(xué)分析，他們向WHO推薦16/190作為參考試劑，并且在說明書中明確說明賦值采用的是當(dāng)前的免疫分析法，筆者亦認(rèn)為這種做法是合理的。在未來可嘗試以人血清為基質(zhì)建立AMH參考盤，或者采用提取的人源性AMH制備國際標(biāo)準(zhǔn)品，以協(xié)調(diào)AMH免疫分析方法之間的差異，促進(jìn)AMH免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)化。