劉子豪 蔣林樹 南雪梅 熊本海*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.北京農(nóng)學院動物科學技術學院，北京102206)

MicroRNA(miRNA)是一種長度為18～25 nt的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，在不同物種間高度保守，其通過誘導mRNA的降解或阻斷其翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1-2]。多項研究表明，miRNA與乳腺、骨骼肌[3]、卵泡[4]、肝臟[5]、晶狀體[6]、免疫細胞[7]等幾乎所有組織、器官、細胞的發(fā)育密切相關。哺乳動物乳腺是動物體中少數(shù)反復經(jīng)歷發(fā)育、功能分化和退化的器官之一。乳腺發(fā)育和泌乳是一個復雜的過程，受多種激素、細胞因子及miRNA等的共同調(diào)控[8]。從理論上講，了解乳腺發(fā)育和泌乳的精準調(diào)控網(wǎng)絡，對于更好地了解乳腺生理功能及調(diào)節(jié)規(guī)律至關重要；從生產(chǎn)上講，我國對奶牛生產(chǎn)的需求已經(jīng)從過去單方面追求產(chǎn)量轉(zhuǎn)變?yōu)閷|(zhì)量和產(chǎn)量的雙重追求，最大程度地調(diào)動乳腺潛能，是行業(yè)需求。因此，本文擬從激素對乳腺miRNA表達譜的調(diào)控及乳腺miRNA對激素受體及其下游通路的調(diào)控2個角度，揭示奶牛乳腺激素相關miRNA的研究進展及方向，以期助力于乳腺生物學的發(fā)展及奶產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

1 激素對乳腺miRNA表達譜的影響

乳腺組織的miRNA表達譜在不同泌乳階段存在差異[9]，并能對細菌侵襲[10-11]、熱應激[12]、營養(yǎng)[13]等環(huán)境改變產(chǎn)生應答。在此過程中，激素，尤其是泌乳相關激素，是誘導乳腺miRNA變化的重要原因之一。

研究表明，地塞米松、胰島素(INS)、催乳素(PRL)等生乳激素能夠改變奶牛乳腺上皮細胞(BMEC)miRNA的表達譜。Muroya等[14]研究表明，生乳激素的添加顯著降低BMEC中miR-21-5p、miR-26a及miR-320a的表達，并減少培養(yǎng)基中miR-339a的豐度，同時誘導培養(yǎng)基中miR-148表達上調(diào)。此外，有報道牛乳中miR-148a的含量在哺乳第5個月開始減少[15-16]，說明激素誘導的miRNA與乳蛋白合成、乳腺發(fā)育和細胞成熟度有關?；诎谢蝾A測的生物信息學分析揭示，在BMEC中被下調(diào)的miRNA與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化和導管發(fā)育等生物學進程相關[14]。

Jiao等[17]探討了PRL/miR-183/胰島素受體底物1(IRS1)途徑調(diào)控奶牛乳脂代謝的分子機制。該研究中，用不同濃度PRL處理BMEC后，在一定的濃度和時間范圍內(nèi)，miR-183的表達與PRL存在相關性。為了確定PRL改變miR-183表達的機制，研究進一步使用甲基化抑制劑(5-aza-dc)處理BMEC，結(jié)果表明，5-aza-dc可部分抑制PRL介導的miR-183的下調(diào)，用亞硫酸氫DNA測序法檢測PRL組和PRL+5-aza-dc組的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)5-aza-dc處理抑制了PRL誘導的DNA甲基化，證實PRL可以通過BMEC甲基化作用抑制miR-183的表達。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，IRS1在泌乳高峰期的乳腺組織中高表達，而miR-183的表達水平與IRS1表達負相關，miR-183可能與IRS1基因的3′UTR位點結(jié)合，并負調(diào)控IRS1基因mRNA和蛋白水平的表達。

此外，萬中英等[18]針對中藥王不留行增乳活性單體鄰苯二甲酸二丁酯和PRL對乳腺上皮細胞內(nèi)源性miRNAs表達的影響開展了研究，結(jié)果兩者均可以抑制原代培養(yǎng)的泌乳中期BMEC中miRNA-143、miRNA-125和miRNA-195表達，該研究進一步證實激素可以改變奶牛乳腺miRNA表達譜，從而發(fā)揮后續(xù)調(diào)控作用。

除奶牛外，研究表明激素對其他物種乳腺miRNA表達同樣具有影響。Hanan等[19]通過小鼠乳腺上皮細胞系中獲得腺泡前體細胞、導管前體細胞和多能前體克隆細胞，其中，腺泡前體細胞中miR-146b的表達明顯高于后兩者。在單獨使用PRL或雌激素和孕酮結(jié)合的激素刺激后，顯著上調(diào)miR-146b的表達[20]。由于研究目的的不同，小鼠等模式動物的研究更傾向于病理機制的探討，而奶牛則更傾向于乳腺生理功能的了解，但是毋庸置疑，奶牛乳腺中激素對miRNA的影響的研究，尚需更多發(fā)掘和拓展。

2 miRNA對激素受體及其下游信號通路的調(diào)控

2.1 對催乳素受體及其下游信號通路的調(diào)控

PRL是一種最為重要的生乳激素，在乳腺發(fā)育、泌乳啟動、乳汁生成等方面發(fā)揮重要作用。多種miRNA可以通過PRL、催乳素受體(PRLR)及其下游信號通路，參與PRL誘導的生物學進程。

泌乳啟動需要自分泌PRL進行誘導，而磷酸酶(PTEN)-磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶(AKT)信號通路能夠內(nèi)源性調(diào)節(jié)PRL的水平[21]。研究證實，PTEN基因是miR-29b在調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育中的重要靶標，PTEN信號蛋白對于PRL自分泌的活動至關重要[22]。此外，在Do等[23]針對miRNA在整個泌乳期的時間表達模式進行的研究中證實，miR-29b/miR-363是乳腺從初乳向常乳生成過渡期信號的重要調(diào)節(jié)物，而泌乳階段之間過渡的相關信號通路涉及細胞凋亡[PTEN和應激活化蛋白激酶(SAPK)/氨基末端激酶(JNK)]、細胞內(nèi)信號傳導[蛋白激酶A、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)]、細胞周期調(diào)節(jié)[信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)]、細胞因子、激素和生長因子等。這說明miRNA可以通過PTEN對PRL及其受體表達發(fā)揮調(diào)控作用。

另一個廣受關注的能夠靶向PRLR的miRNA是miR-142-3p。小鼠乳腺研究中證實，miR-142-3p能夠通過PRLR介導的多個信號通路改變小鼠乳腺的結(jié)構(gòu)及泌乳功能[24]。奶牛乳腺中miR-142-3p功能及機制研究有限，于蕾等[25]發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p在不同乳品質(zhì)的奶牛乳腺組織中均有表達，但相比于處于泌乳期的高乳品質(zhì)乳腺組織和干奶期乳腺組織，泌乳期低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達量最高，證明miR-142-3p在調(diào)控奶牛乳腺的泌乳功能上發(fā)揮作用，在以BMEC為模型的功能學研究中進一步證實，miR-142-3p沉寂后，可以通過改變其靶基因PRLR的表達及其下游信號通路的活性，最終增加BMEC合成β-酪蛋白及甘油三酯的能力。由此可見，miR-142-3p可以通過激素受體及其下游通路，完成對乳腺泌乳的調(diào)控。

2.2 對生長激素受體及其下游信號通路的調(diào)控

乳腺的發(fā)育由生長激素(GH)、雌激素、孕激素和PRL等的復雜相互作用所調(diào)控。GH與生長激素受體(GHR)的結(jié)合觸發(fā)了受非受體型酪氨酸蛋白激酶(JAK2)誘導的下游信號轉(zhuǎn)導過程[26]。整體上講，GHR通過JAK2下游的信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活(STAT)途徑調(diào)節(jié)酪蛋白的生成[27-28]，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑促進乳腺上皮細胞增殖和細胞周期調(diào)整[27]，通過蛋白激酶C(PKC)途徑改變葡萄糖代謝，通過IRS途徑維持細胞的生長、分裂和代謝[29]。因此，研究miRNA通過靶向GHR調(diào)節(jié)奶牛乳腺發(fā)育、泌乳及乳品品質(zhì)生成的機制具有重要意義。

miR-139是奶牛乳腺中發(fā)現(xiàn)的靶向GHR的最重要miRNA之一。Cui等[30]研究發(fā)現(xiàn)，miR-139在泌乳中期奶牛乳腺組織中的表達較妊娠中期下調(diào)，根據(jù)miR-139在奶牛泌乳過程中的作用，對其2個潛在的靶基因GHR和胰島素樣生長因子受體(IGF1R)進行了研究。雙熒光素酶報告基因方法證實miR-139能夠與GHR和IGF1R的3′UTR直接結(jié)合，功能學研究表明miR-139的過表達或沉默改變了BMEC中GHR和IGF1R的mRNA及蛋白表達水平。此外，miR-139的過表達降低了β-酪蛋白的生成，下調(diào)GHR及IGF1R通路中關鍵信號分子的表達，抑制乳腺上皮細胞的增殖，而沉默miR-139則與之相反。沉默GHR降低了β-酪蛋白、IGF1R和IGF1R途徑關鍵信號分子的蛋白水平，而聯(lián)合沉默miR-139和GHR則提高了GHR的表達水平并逆轉(zhuǎn)了GHR的沉默效應。研究表明，GH可以通過刺激肝臟分泌IGF1間接作用于乳腺，誘導乳腺中miRNA表達的改變[31]。以上研究證實，GHR和IGF1R是奶牛乳腺中miR-139的靶基因，miR-139可通過靶向GHR和IGF1R改變其下游信號通路，從而抑制BMEC中β-酪蛋白的合成和細胞增殖。

另一個已被證實直接靶向GHR的miRNA是bta-miR-15a。bta-miR-15a位于牛12號染色體18 887 743～18 887 825 bp[32]，在細胞發(fā)育、細胞周期[33]和死亡[34-35]調(diào)節(jié)中起重要作用。Li等[36]針對miR-15a在奶牛乳腺中的表達和功能開展了研究。結(jié)果表明，bta-miR-15a可以調(diào)節(jié)荷斯坦奶牛乳腺的發(fā)育，利用TargetScan5.1軟件預測GHR基因是bta-miR-15a的潛在靶基因。研究進一步將bta-miR-15a模擬物或抑制劑分別轉(zhuǎn)染BMEC，隨后采用定量實時PCR、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和CASY-TT等技術對泌乳相關基因和蛋白的表達進行了研究和分析，確定bta-miR-15a與GHR的調(diào)控關系。結(jié)果表明，當轉(zhuǎn)染bta-miR-15a mimic時，bta-miR-15a的表達比內(nèi)源性水平提高8.4倍，同時GHR的表達降低，當轉(zhuǎn)染bta-miR-15a抑制劑時則效果相反。Western blot結(jié)果表明，bta-miR-15a轉(zhuǎn)染可降低GHR和酪蛋白的表達。由此說明，bta-miR-15a能夠在翻譯水平上抑制GHR蛋白的表達，間接影響酪蛋白的合成，其作用機制可能是miR-15a抑制GHR的調(diào)節(jié)作用，從而影響JAK2-STAT5信號通路，并最終降低β-酪蛋白的生成。

2.3 其他激素相關miRNA

除PRL及GH外，還有多種激素在乳腺發(fā)育和泌乳調(diào)控中發(fā)揮作用。瘦素(leptin)是脂肪細胞分泌的內(nèi)分泌/旁分泌激素。在乳腺中，脂肪墊及脂肪細胞合成的瘦素能夠與其他激素互作，發(fā)揮重要作用。研究表明，瘦素能夠增加PRL的生乳能力[37]，PRL、瘦素和雌激素的聯(lián)合會增加β-乳球蛋白的表達[38]，瘦素受體(LEPR)則在哺乳動物乳腺發(fā)育、泌乳及退化過程中起重要作用[39]。門晶等[40]采用靶基因預測軟件，發(fā)現(xiàn)LEPR是miR-30d的潛在靶基因。該研究首先構(gòu)建了包含與miR-30d靶向結(jié)合的LEPR序列的重組熒光素酶報告載體，將miR-30d與重組熒光素酶載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細胞進行片段化，檢測熒光素酶活性，該研究確定LEPR是miR-30d的靶基因，并參與調(diào)控奶牛乳腺的生長發(fā)育和泌乳功能。

此外，對乳腺而言，INS是另一個重要的調(diào)節(jié)激素。INS一方面可以增加乳產(chǎn)量[41]，另一方面與乳腺細胞的發(fā)育、存活及營養(yǎng)分配密切相關[42-43]。Wang等[9]在對奶牛產(chǎn)后30 d乳腺組織miRNA及其靶基因表達進行聯(lián)合分析時發(fā)現(xiàn)，胰島素受體(INSR)可能是miR-15/16、miR-181a、miR-221、miR-223的作用靶點。其中，miR-221在泌乳早期的表達低于泌乳高峰期，而miR-223則相反。此外，雙重熒光素酶報告基因方法表明，IRS1、STAT5A及STAT3是miR-221的靶基因[44]。隨后的分析揭示，miR-221模擬物的轉(zhuǎn)染導致STAT5A和IRS1在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達顯著降低。同時，miR-221轉(zhuǎn)染后，JAK-STAT和PI3K-AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路中受STAT5A和IRS1調(diào)節(jié)的下游分子細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(SOCS3)、AKT3和mTOR的表達均發(fā)生了變化。該研究證實，miR-221通過靶向STAT5A和IRS1(PI3K-Akt/mTOR和JAK-STAT信號傳導途徑的關鍵基因)抑制乳腺上皮細胞增殖。

3 小 結(jié)

乳腺是一種獨特的組織，在成年期經(jīng)歷細胞增殖、分化和凋亡的周期。乳腺的發(fā)育是通過內(nèi)分泌激素，包括GH、孕激素、PRL及其他激素相互作用，完成乳腺的周期性變化及泌乳功能的調(diào)節(jié)。miRNA作為調(diào)節(jié)生物學功能和乳腺發(fā)育的一類分子不容忽視。一方面，激素可以通過對miRNA表達譜的影響，完成對更多生物學功能的調(diào)節(jié)，使激素作用的范圍更加深廣;另一方面，miRNA通過直接靶向激素受體及其下游信號通路分子，參與到激素相關的調(diào)節(jié)功能中，使信號的傳遞更完善，使調(diào)節(jié)更精準。

雖然針對miRNA在牛乳腺中的特殊生物學作用多有研究報道，但與乳腺激素有關的miRNA在牛乳腺中的作用機制還有待完善，這方面相關研究的深入和拓展可以為更好地了解乳腺生物學提供助益，更為促進乳腺健康、提高乳腺泌乳能力提供必要的理論信息和指導方向。