周 陽 金 巍,* 向小娥 成艷芬, 朱偉云,

(1．國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點實驗室，南京農業(yè)大學消化道微生物研究室，南京210095；2．南京農業(yè)大學動物科學類國家級實驗教學中心，南京210095)

三甲胺(trimethylamine，TMA)是反芻動物瘤胃中重要的微生物代謝中間產物，它主要來源于瘤胃細菌對飼料中的膽堿和甜菜堿等甲基化合物的降解[1-2]。膽堿和甜菜堿是反芻動物重要的營養(yǎng)成分[3-4]，但飼糧中膽堿和甜菜堿易被瘤胃微生物降解成三甲胺，這不僅降低了飼料養(yǎng)分利用率，三甲胺在瘤胃中被甲烷菌轉化成甲烷[5-6]，還進一步增加了反芻動物甲烷排放量。甲烷是一種重要的溫室氣體，約占全球溫室氣體總排放量的14%[7]。因此，深入研究瘤胃中三甲胺的代謝具有重要意義。

目前已有多種三甲胺檢測方法。苦味酸衍生法和福林酚結合法的測定結果易受其他胺(一甲胺和二甲胺)的影響[8-10]。高效液相色譜法檢測三甲胺需要先衍生化，以促進化合物的分離和檢測[11]。液相色譜-質譜聯(lián)用(LS-MS)法是一種準確而靈敏的三甲胺測定方法[12-13]，但LS-MS法的儀器價格昂貴且使用技術要求較高。因此，建立一種對儀器要求較低、操作步驟簡單、快速、準確，且適用于檢測瘤胃發(fā)酵液樣品的三甲胺檢測方法是必要的。

本試驗優(yōu)化了樣品的預處理條件和氣相色譜的分離程序，在色譜分析程序的設定上參考了大量文獻[14-18]，研究不同溶劑對制備標準曲線的影響，旨在建立一種適用于測定瘤胃體外發(fā)酵液中三甲胺濃度的氣相色譜法。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液供體動物

選擇3頭裝有永久性瘤胃瘺管的非泌乳荷斯坦奶牛作為瘤胃液的供體動物，平均體重為(748±59) kg。每天在08：00和17：00各飼喂1次，自由飲水?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.2 儀器與試劑

安捷倫7890A氣相色譜儀(美國Agilent公司)，氫火焰離子檢測器(FID)。WEL-PEG20M(30 m×0.25 mm×0.5 μm)氣相色譜柱；Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R微量離心機(德國ThermoFisher公司)。

三甲胺鹽酸鹽(美國Sigma公司)純度為98%；氫氧化鉀(KOH)(國藥集團化學試劑有限公司)為分析純；水為超純水(經檢測不含三甲胺)。

1.3 試驗方法

1.3.1 瘤胃體外發(fā)酵

瘤胃體外發(fā)酵試驗參照Menke等[19]的方法。于早晨飼喂前，通過瘤胃瘺管采集瘤胃液，在厭氧條件下，將瘤胃液經4層紗布過濾。將瘤胃液濾液和發(fā)酵緩沖液按照1∶3的比例混合配制成發(fā)酵液，發(fā)酵緩沖液組成成分見表2。每個發(fā)酵瓶(100 mL)分裝60 mL發(fā)酵液，用橡膠塞和鋁蓋密封，并在39 ℃下發(fā)酵24 h。每個發(fā)酵瓶在分裝發(fā)酵液之前，添加0.6 g稻秸(0.42 mm)作為發(fā)酵底物。試驗分為2組，對照組(n=4)和試驗組(n=4)。試驗組每個發(fā)酵瓶中含有0.041 4 g三甲胺鹽酸鹽(即添加濃度約為0.69 mg/mL)。在發(fā)酵開始(0 h)和發(fā)酵結束(24 h)時分別采集2 mL發(fā)酵上清液，用于三甲胺濃度的檢測。

1.3.2 三甲胺標準溶液和KOH溶液配制

三甲胺標準溶液的制備：分別采用超純水和無三甲胺背景值的發(fā)酵培養(yǎng)基(經15 000×g離心10 min)2種溶劑制備。三甲胺標準溶液設置8個濃度梯度，分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL。三甲胺標準溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。

KOH溶液制備：采用超純水作為溶劑，設置6個濃度梯度，分別為6、8、10、12、15、20 mol/L。

1.3.3 氣相色譜程序

進樣口溫度220 ℃；檢測器溫度220 ℃；柱溫箱采用程序升溫，60 ℃，保持3 min，45 ℃/min升溫至150 ℃，150 ℃保持2 min?？偝绦驎r間6.5 min。氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮氣流速25 mL/min。色譜柱氣體流速1 mL/min，分流比為30∶1。

表2 發(fā)酵緩沖液組成成分

1.3.4 樣品前處理

取1.0 mL標準溶液或樣品，15 000×g、4 ℃離心5 min[10]。取200 μL上清液，加入50 μL KOH溶液，混合均勻，充分堿化，將離子態(tài)三甲胺轉化成分子態(tài)三甲胺[20]?；旌弦?5 000×g、4 ℃離心2 min，上清液經0.22 μm水相濾器過濾，取1 μL濾液上機檢測。

1.3.5 回收率、精確度和數(shù)據(jù)分析

回收率：在2個已知三甲胺濃度的樣品中分別加入0.1和0.6 mg/mL三甲胺標準溶液，每個濃度設置4個重復，測定回收率。

回收率(%)=100×(混合樣品檢測值-
樣品背景檢測值)/添加量標準值。

精確度：重復測量樣品中三甲胺濃度6次，分析檢測方法的可重復性和再現(xiàn)性。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 25.0軟件中的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

如圖1所示，三甲胺在2.55 min左右出峰，峰被很好地分離并形成尖銳對稱峰。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

如圖2所示，在三甲胺標準溶液中分別添加6、8、10、12、15、20 mol/L KOH溶液進行處理，結果表明，KOH溶液對三甲胺峰面積影響顯著(P<0.05)。10 mol/L KOH溶液處理得到的三甲胺峰面積最大(174.67 pA·s)，顯著高于其他濃度KOH溶液(P<0.05)。結果還顯示，KOH溶液濃度過低或過高均會影響檢測結果，因此針對不同的樣品首先需要確定KOH溶液濃度，對樣品進行恰當?shù)念A處理。

圖1 三甲胺色譜圖

數(shù)據(jù)點標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同溶劑制備三甲胺標準曲線

如表3所示，2種溶劑制備的三甲胺標準曲線均有良好的線性關系(R2=0.996、R2=0.993)，且2種溶劑下的三甲胺出峰時間(保留時間)一致。根據(jù)信噪比(S/N)=3計算檢測限，以超純水為溶劑的三甲胺檢測限為0.005 mg/mL，優(yōu)于以發(fā)酵液為溶劑的檢測限(0.010 mg/mL)。根據(jù)S/N=10計算定量限，以超純水為溶劑的定量限為0.018 mg/mL，而以發(fā)酵液為溶劑的定量限為0.040 mg/mL。需要注意的是2個標準曲線回歸方程差異很大。

表3 不同溶劑制備的三甲胺標準曲線

如圖3所示，0.1 mg/mL的三甲胺標準溶液以超純水作為溶劑獲得的峰面積為101.12 pA·s，而以發(fā)酵液為溶劑獲得的峰面積為12.53 pA·s。可見溶劑對三甲胺檢測結果影響非常大。

圖3 不同溶劑制備的三甲胺標準溶液色譜圖

2.4 瘤胃體外發(fā)酵液樣品的檢測

如表4所示，對照組中未檢測到三甲胺，說明對照組發(fā)酵液中三甲胺濃度低于本方法的檢測限。試驗組發(fā)酵初始時添加的三甲胺濃度為0.69 mg/mL，采用超純水為溶劑制備的標準曲線方程，計算得到的三甲胺濃度為0.90 mg/mL；而以發(fā)酵液為溶劑制備的標準曲線方程，計算得到的三甲胺濃度為0.65 mg/mL，這與理論添加量相符合，略有減少可能是由于三甲胺在添加過程中的損失，或者是在從添加到取樣這段時間內被降解，導致測定值比理論添加值偏低。試驗組發(fā)酵24 h后，三甲胺濃度為0.12 mg/mL，表明三甲胺被瘤胃微生物大量利用。

2.5 三甲胺回收率和檢測精確度

如表5所示，2個濃度的三甲胺回收率均接近100%，相對標準偏差<5%。

如表6所示，樣品S1中三甲胺平均濃度為0.64 mg/mL，相對標準偏差為3.95%。樣品S2中三甲胺平均濃度為0.11 mg/mL，相對標準偏差為7.42%。這表明該方法測定含三甲胺濃度較高的樣品比含三甲胺濃度較低的樣品精度更高。

3 討 論

瘤胃體外發(fā)酵液呈酸性，三甲胺呈離子態(tài)，在氣化室中較難汽化，因此需要對樣品進行堿化處理，將離子態(tài)三甲胺轉化成分子態(tài)三甲胺。用KOH對樣品進行前處理是三甲胺檢測的常用方法[10,14,21]。樣品堿化不充分，三甲胺轉化不完全，會導致檢測值偏小。堿化過度也會導致過多的鉀離子(K+)進入色譜系統(tǒng)，對氫離子火焰檢測器產生干擾，導致檢測值偏小。此外，用KOH預處理也能使發(fā)酵液中的蛋白質沉淀，降低樣品對氣化室的污染。檢測肉產品和魚蝦等水產品中三甲胺濃度的方法，采用三氯乙酸沉淀樣品中的蛋白質[14,22]。本文用KOH預處理也可以在一定程度上達到除蛋白質的目的，在后續(xù)的研究中可嘗試在KOH預處理前增加三氯乙酸處理步驟，提高樣品的純凈度。采用頂空進樣氣相色譜法分析三甲胺確實是一個比較好的分析方法，能一定程度上減少對色譜柱和汽化室的污染，本文采用直接進水相樣品的方法，考慮的是發(fā)酵液中三甲胺濃度較低，頂空法可能不能夠將樣品中的三甲胺完全釋放出來，導致檢測值偏低，影響檢測結果的準確度。

表4 瘤胃體外發(fā)酵液中三甲胺濃度

表5 瘤胃體外發(fā)酵液中三甲胺回收率

表6 分析方法的重復性和再現(xiàn)性

以超純水為溶劑制備的三甲胺標準溶液檢測得到的三甲胺峰面積顯著高于以發(fā)酵液為溶劑制備的標準溶液，這可能是由于發(fā)酵液中某些成分干擾了三甲胺的信號強度。這一現(xiàn)象導致利用以超純水為溶劑制備的三甲胺標準曲線計算樣品中三甲胺的濃度時得到的數(shù)值高于實際值。因此，制備標準曲線的溶劑應與所檢測樣品的背景溶液相同。

本方法未能檢測到對照組中三甲胺，說明樣品中三甲胺濃度低于本方法檢測限。Martinez-Fernandez等[23]利用核磁共振法檢測了飼喂一種熱帶牧草的波羅門牛瘤胃液中的代謝產物，發(fā)現(xiàn)三甲胺濃度為0.334～0.564 mmol/L。本方法的檢測限為0.01 mg/mL(即0.169 mmol/L)，本文中的發(fā)酵液是將瘤胃液按1∶3的比例稀釋制備而成，這可能是導致未能檢測到對照組發(fā)酵液中三甲胺的原因。

4 結 論

本試驗建立的利用氣相色譜快速檢測三甲胺濃度的方法前處理簡單、檢測結果準確度較高，可以快速高效檢測瘤胃體外發(fā)酵液中三甲胺的濃度變化，適用于瘤胃微生物三甲胺代謝的體外研究。