盧 樺 李戰(zhàn)福 黃先智 李 虹 翟旭亮 薛 洋 劉長江 徐杭忠 羅 莉*

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；2.家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；3.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶401121)

桑葉提取物(mulberry leaf extract，MLE)因含有大量的多糖類、黃酮類、生物堿類、植物甾醇類等活性物質(zhì)而備受關(guān)注[1]，但其作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用較少。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加7.3～7.5 g/kg的MLE可顯著增加大鯢(Andriasdavidianus)攝食量，并提高其腸胃消化吸收、肝臟抗氧化及機(jī)體免疫能力[2]。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是一種多羥基哌啶生物堿，因具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等生物活性而被認(rèn)為有較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[3-4]。盡管這些特性使得DNJ在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但關(guān)于NDJ作為功能性飼料添加劑在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。

大鯢為我國特有且體型最大的珍稀兩棲動(dòng)物，原生態(tài)、仿生態(tài)和工廠化養(yǎng)殖3種模式的大鯢人工養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)基本成熟且已形成一定規(guī)模。目前，對大鯢人工配合飼料的研究報(bào)道很少，且停留在基礎(chǔ)性的營養(yǎng)需求探索及動(dòng)物餌料之間或單純的人工飼料與天然餌料之間的對比階段[5-7]。人工養(yǎng)殖過程中還是以鮮活魚蝦為主要飼料，人工規(guī)?；B(yǎng)殖難以推行。本課題組前期已成功研發(fā)能滿足大鯢生長過程中營養(yǎng)供給的人工配合飼料，在重慶、四川、貴州、廣西等多地的養(yǎng)殖基地通過試驗(yàn)證明其均保持較低的飼料系數(shù) ( feed conversion ratio， FCR )[2]。另外，因MLE中含有DNJ，但MLE和DNJ分別添加在大鯢飼料中的效果差異不得而知。鑒于此，本試驗(yàn)旨在研究MLE和DNJ對大鯢生長性能、肝臟功能及免疫能力的影響，為生產(chǎn)安全、綠色、優(yōu)質(zhì)的大鯢人工配合飼料添加劑的選擇及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所選用的大鯢購于陜西省漢中市綠源大鯢養(yǎng)殖場，MLE由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，DNJ(高相液相色譜分析標(biāo)準(zhǔn)品，其純度≥98%)購于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，飼料所需原料均購于重慶市大發(fā)飼料有限公司。

以魚粉、雞肉粉等為蛋白質(zhì)源，以大豆油為脂肪源，配制大鯢基礎(chǔ)飼料；在基礎(chǔ)飼料中分別添加7.5 g/kg的MLE和0.04 g/kg的DNJ(MLE添加量參照本課題組前期試驗(yàn)[2]，該添加量下飼料中DNJ實(shí)測含量為0.04 g/kg)，經(jīng)膨潤土調(diào)平，配制成3種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料均過40目篩，用混合制粒機(jī)(四川棉豐農(nóng)業(yè)機(jī)械制造廠9FZ-35C型)制成直徑3 mm、長6～8 mm的軟顆粒飼料，冷卻后低溫晾干，再用雙層塑料袋包裝并封口，置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選擇初始均重為(47.81±0.23) g的大鯢72尾，隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8尾。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組分別飼喂基礎(chǔ)飼料中添加7.5 g/kg MLE(MLE組)和0.04 g/kg DNJ(DNJ組)的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)期90 d。

試驗(yàn)大鯢購回后靜養(yǎng)2 d，用1%氯化鈉溶液浸泡消毒5 min，饑餓暫養(yǎng)5 d再以大鯢基礎(chǔ)飼料馴食15 d，待大鯢體質(zhì)恢復(fù)后開展正式試驗(yàn)。試驗(yàn)大鯢放養(yǎng)在室內(nèi)藍(lán)色塑料方形箱(70.5 cm×45.5 cm×17.5 cm，水深5 cm)中，水源為經(jīng)12 h曝氣的自來水。因大鯢消化食物時(shí)間較長，故連續(xù)投喂2 d間歇1 d，每天1次(17:00)，飽食投喂，投喂當(dāng)天(20:00)及時(shí)用網(wǎng)孔密集的網(wǎng)兜收集殘余餌料并計(jì)重。每天早晚各換水1次。飼養(yǎng)期間避光，水溫19～22 ℃，溶解氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量<0.10 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.10 mg/L，pH在6.5～7.5。

1.3 樣品采集與制備

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)大鯢停喂3 d，用MS-222(0.1 g/L)麻醉后，每組每個(gè)重復(fù)的8尾大鯢全用于體質(zhì)量、體長的測定。其中5尾大鯢在冰盤中解剖，用1 mL無菌注射器吸取1%肝素鈉進(jìn)行腹部動(dòng)脈采血，4 ℃靜置3 h后，4 000 r/min離心提取血漿，立即放入液氮速凍，后置于-80 ℃冰箱中，用于血漿生化指標(biāo)測定；采血后取出內(nèi)臟并稱重，分離出肝臟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心沖洗，并將肝臟迅速液氮速凍，后置于-80 ℃冰箱中，用于肝臟營養(yǎng)成分及相關(guān)酶活性測定；將背部肌肉皮膚去除后取出肌肉，置于-80 ℃冰箱中，用于肌肉營養(yǎng)成分測定。

1.4 指標(biāo)測定

生長性能指標(biāo)測定：養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停食3 d，準(zhǔn)確稱量各組大鯢體重、內(nèi)臟重和殘餌重，計(jì)算其增重率(weight gain rate，WGR)、攝食量(feed intake，F(xiàn)I)、特定生長率(specific growth rate，SGR)、FCR和存活率(survival rate，SR)，計(jì)算公式如下：

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0；
FI(g/尾)=(∑F0-∑Fr)/Nt；
SGR(%/d)=100×(lnWt-lnW0)/d；
FCR=F/(Wt-W0)；
SR(%)=100×Nt/N0。

式中：W0為起始均重(g)；Wt為終末均重(g)；d為養(yǎng)殖試驗(yàn)天數(shù)(d)；F0為每次投喂量(g)；Fr為每次殘餌量(g)；F為攝食量(g)；N0為初始尾數(shù)；Nt為終末尾數(shù)。

試驗(yàn)飼料及組織常規(guī)營養(yǎng)成分的測定：水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分含量分別采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、索氏抽提法(GB/T 6433—1994)、550 ℃灼燒法(GB/T 6438—1992)進(jìn)行測定。肝臟粗脂肪含量采用氯仿-甲醇法測定。

肝臟抗氧化指標(biāo)的測定：肝臟總抗氧化能力(T-AOC)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

肝臟功能和血漿免疫指標(biāo)的測定：血漿肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性和免疫球蛋白M(IgM)、活性氧(ROS)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏多重比較法分析組間差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié) 果

2.1 MLE和DNJ對大鯢生長性能及飼料利用的影響

由表2可知，MLE組和DNJ組的終末均重、WGR、SGR和FI均顯著高于對照組(P<0.05)，而MLE組和DNJ組之間無顯著差異(P>0.05)。MLE組和DNJ組的WGR較對照組分別升高了38.88%和45.55%。MLE組和DNJ組的FCR均顯著低于對照組(P<0.05)，較對照組分別降低了17.39%和21.74%。各組大鯢存活率均為100%。

2.2 MLE和DNJ對大鯢肌肉和肝臟營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，MLE組和DNJ組的肌肉和肝臟粗脂肪含量均顯著低于對照組(P<0.05)。MLE組和DNJ組的肌肉粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組(P<0.05)，較對照組分別升高了13.13%和8.31%。MLE組的肌肉水分含量顯著低于對照組(P<0.05)，MLE組和DNJ組的肝臟水分含量顯著低于對照組(P<0.05)。

表2 MLE和DNJ對大鯢生長性能及飼料利用的影響

表3 MLE和DNJ對大鯢肌肉和肝臟營養(yǎng)成分的影響(鮮樣基礎(chǔ))

2.3 MLE和DNJ對大鯢肝臟功能的影響

2.3.1 MLE和DNJ對大鯢肝臟脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

由圖1可知，MLE組和DNJ組的血漿CPT-1、ACC活性及CPT-1/ACC均顯著高于對照組(P<0.05)，且DNJ組的血漿CPT-1、ACC活性及CPT-1/ACC顯著高于MLE組(P<0.05)。

2.3.2 MLE和DNJ對大鯢肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，MLE組和DNJ組的肝臟T-AOC、T-SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，肝臟MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)。MLE組的肝臟T-AOC、T-SOD活性顯著高于DNJ組(P<0.05)，肝臟MDA含量顯著低于DNJ組(P<0.05)。

2.3.3 MLE和DNJ對大鯢血漿轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

由圖2可知，MLE組和DNJ組的血漿AST和ALT活性顯著低于對照組(P<0.05)，MLE組的血漿AST和ALT活性顯著低于DNJ組(P<0.05)。

2.4 MLE和DNJ對大鯢血漿IgM和ROS含量的影響

由圖3可知，MLE組和DNJ組的血漿IgM含量顯著高于對照組(P<0.05)，MLE組的血漿IgM含量顯著高于DNJ組(P<0.05)。MLE組和DNJ組的血漿ROS含量顯著低于對照組(P<0.05)，DNJ組的血漿ROS含量顯著低于MLE組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

表4 MLE和DNJ對肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

圖2 MLE和DNJ對大鯢血漿轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

圖3 MLE和DNJ對大鯢血漿IgM和ROS含量的影響

3 討 論

3.1 MLE和DNJ對大鯢生長性能及飼料利用的影響

MLE中的某些活性物質(zhì)已應(yīng)用于多種動(dòng)物飼料并在改善動(dòng)物生長性能方面有良好的飼用價(jià)值。在斷奶犢牛[8]、綿羊[9]上的研究證實(shí)，適宜桑葉黃酮的添加有利于改善胃腸道結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)相關(guān)消化酶活性，從而提升了動(dòng)物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加MLE和DNJ能促進(jìn)大鯢生長，與對照組相比，MLE組和DNJ組的FCR顯著降低，WGR顯著提高。這說明大鯢的生長性能得到改善，飼料中添加MLE和DNJ具有同等效應(yīng)。MLE中的多種單體活性物質(zhì)可通過不同方式促進(jìn)不同種類動(dòng)物的生長，因而MLE具有多種單體物質(zhì)聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的優(yōu)勢。Li等[10]發(fā)現(xiàn)DNJ可特異性調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道菌群，更好地參與機(jī)體能量代謝和營養(yǎng)物質(zhì)吸收過程，進(jìn)而影響機(jī)體生長狀況。本研究結(jié)果也顯示，MLE中的DNJ對大鯢的生長有同樣的促進(jìn)效果。關(guān)于DNJ促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育機(jī)制有待進(jìn)一步研究。與以上結(jié)果不同的是，在育肥豬上的研究顯示，桑葉粉的添加會降低其生長性能[11]。一方面，養(yǎng)殖對象的不同、桑葉的不同加工處理方式或添加量可能對生長性能造成不同效果；另一方面，高劑量的添加也增加了其中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的含量，從而阻止機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。作為植物性添加劑，MLE和DNJ的添加反而增加了大鯢的FI，這與在犢牛上的研究結(jié)果[8]一致；這可能與MLE特征性的氣味具有一定誘食性有關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)在前期的研究中已證實(shí)，適量添加MLE可提高大鯢消化吸收酶活性并改善腸道發(fā)育狀況，從而促進(jìn)其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用[2]。因而，MLE和DNJ促進(jìn)大鯢生長的原因可能是大鯢攝食量、消化吸收能力、生長性能三者之間相互作用。

3.2 MLE和DNJ對大鯢體組成的影響

本研究表明，MLE在增加肌肉粗蛋白質(zhì)含量方面的效果顯著優(yōu)于DNJ。這可能是由于MLE中含有甾醇，它可在機(jī)體內(nèi)形成植物甾醇核糖核蛋白復(fù)合體，該復(fù)合體具有促進(jìn)動(dòng)物蛋白質(zhì)合成的功能[12]。桑葉中氨基酸含量豐富，尤其是必需氨基酸，因此可作為飼料強(qiáng)化劑，與其他氨基酸互補(bǔ)，有利于蛋白質(zhì)在體內(nèi)的合成[13]。同時(shí)，兩者的添加都能降低肌肉和肝臟的粗脂肪含量。王玲等[14]研究發(fā)現(xiàn)，DNJ對控制飲食的肥胖大鼠重量的主要調(diào)控途徑是通過調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子的分泌來控制脂肪酸代謝過程中的相關(guān)酶活性，進(jìn)而減少脂肪積累。大鯢相比其他魚類其水分含量高，粗脂肪含量低。本研究中，飼料中添加MLE和DNJ均能降低大鯢肌肉水分和粗脂肪含量，因而機(jī)體粗蛋白質(zhì)占比有所提升。這也為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)動(dòng)物產(chǎn)品以及拓寬飼料桑葉或MLE新用途提供了新思路。

3.3 MLE和DNJ對大鯢肝臟功能的影響

大鯢作為兩棲類動(dòng)物已進(jìn)化出獨(dú)立的肝臟且在機(jī)體中占有重要地位，肝臟承擔(dān)體內(nèi)代謝、排泄和解毒等重要生理功能，最能反映機(jī)體的營養(yǎng)、生理和病理狀態(tài)[15]。

3.3.1 MLE和DNJ對大鯢肝臟脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

眾所周知，桑葉不僅在改善動(dòng)物生長性能方面效果良好，且因其具降血糖、降血脂[16]功能而引起醫(yī)藥、畜禽飼料行業(yè)的廣泛關(guān)注。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加MLE和DNJ均能顯著提高血漿中作為β-氧化的關(guān)鍵限速酶CPT-1和脂肪酸從頭合成途徑關(guān)鍵限速酶ACC的活性。這表明兩者均可通過影響與肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶活性而達(dá)到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的目的。在小鼠上的研究認(rèn)為MLE的降血脂作用歸因于抑制脂質(zhì)合成和促進(jìn)脂質(zhì)降解[17]。此外，DNJ可刺激腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)mRNA的表達(dá)，一定程度上激活動(dòng)態(tài)平衡中脂肪酸β-氧化系統(tǒng)AMPK→ACC→CPT-1通路，從而抑制脂質(zhì)在肝臟的聚積及肌內(nèi)脂肪沉積[18]。與此同時(shí)，MLE組和DNJ組的CPT-1/ACC顯著高于對照組，則進(jìn)一步說明大鯢整體脂肪酸分解代謝能力強(qiáng)于合成代謝能力，這也與肝臟中粗脂肪的含量在添加MLE和DNJ后表現(xiàn)為降低相符合，更進(jìn)一步證實(shí)了MLE和DNJ可減少脂肪在肝臟的儲存，因而對肝臟功能的健康有積極影響。

3.3.2 MLE和DNJ對大鯢肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

T-AOC和T-SOD活性大小代表生物體清除體自內(nèi)由基能力，是抗氧化系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)，在免疫系統(tǒng)中也有極為重要的作用[19]。本研究中，飼料中添加MLE和DNJ提高了肝臟T-AOC和T-SOD活性，且MLE的添加效果更優(yōu)。MLE可增強(qiáng)抗氧化指標(biāo)的活性與MLE應(yīng)用于吉富羅非魚上的研究結(jié)果[20]一致。這可能與MLE中含有豐富的黃酮類化合物槲皮素、蕓香苷、生物堿化合物DNJ及其衍生物[21]以及多糖、多酚等[22-23]具有清除自由基、抗氧化功能的多種活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。Horng等[24]證實(shí)MLE具有保護(hù)小鼠肝臟免受對乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的炎癥作用，其保護(hù)機(jī)制可能與MLE調(diào)節(jié)抗氧化狀態(tài)、降低氧化應(yīng)激有關(guān)。目前，NDJ作為單體應(yīng)用于動(dòng)物人工配合飼料中的研究仍是空白。在本研究中，DNJ應(yīng)用于大鯢基礎(chǔ)飼料中在抗氧化能力方面的效果不及MLE。脂質(zhì)過氧化可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，MDA正是脂質(zhì)過氧化物穩(wěn)定的終產(chǎn)物，可反映出細(xì)胞受損傷的程度[25]。本試驗(yàn)中，飼料中添加MLE和DNJ后肝臟MDA含量均顯著降低，可進(jìn)一步證實(shí)MLE和DNJ的攝取和補(bǔ)充通過提升肝臟T-AOC和T-SOD活性來增加大鯢抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激，從而清除自由基和ROS，降低MDA含量，減緩肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度并提高非特異性免疫，最終達(dá)到保證肝臟行使其正常功能的目的。

3.3.3 MLE和DNJ對大鯢血漿轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

AST和ALT主要存在于肝臟細(xì)胞中，機(jī)體早期肝臟受損或疾病常伴有血液中AST和ALT活性的升高。本研究結(jié)果表明，飼料中添加MLE和DNJ顯著降低了血漿AST和ALT活性，且MLE組的血漿AST和ALT活性顯著低于DNJ組。這表明MLE和DNJ的添加對大鯢肝功能具有改善作用，因此，因肝損傷進(jìn)入血液中的AST和ALT活性有所降低。這也進(jìn)一步證實(shí)MLE和DNJ可以有效保護(hù)脂肪對肝細(xì)胞的傷害，進(jìn)而改善肝臟健康，且MLE的作用效果優(yōu)于DNJ。

3.4 MLE和DNJ對大鯢免疫能力的影響

研究表明，眾多植物提取物中的活性物質(zhì)因?qū)γ庖呦到y(tǒng)有一定的影響而被用作免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑[26-27]。本研究表明，飼料中添加MLE和DNJ顯著提高了血漿IgM含量，但DNJ提升效果不及MLE。目前，關(guān)于MLE對動(dòng)物免疫能力的改善多集中在桑葉多糖的研究上，IgM作為血液循環(huán)中的主要抗體之一，參與中和抗原和促進(jìn)抗原吞噬等重要的體液免疫反應(yīng)[28]，陳曉蘭等[29]研究表明，桑葉粗多糖和桑葉水提物在合適濃度下能促進(jìn)小鼠脾臟B、T淋巴細(xì)胞的增殖。Zhao等[30]將桑葉多糖與桑葉黃酮共同應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧中可增強(qiáng)免疫能力，降低腹瀉發(fā)生率。ROS是細(xì)胞信號傳導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖調(diào)控的胞內(nèi)信使，其含量異常將導(dǎo)致氧化應(yīng)激和抗氧化防御間平衡失調(diào)，進(jìn)一步破壞機(jī)體免疫能力甚至組織損傷[31]。本試驗(yàn)中，飼料中添加MLE和DNJ顯著降低了血漿ROS含量，這說明ROS的產(chǎn)生受到抑制或已產(chǎn)生的ROS得到清除。這些研究結(jié)果表明，MLE具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究認(rèn)為MLE中的多糖或與MLE中的多酚、DNJ等活性物質(zhì)共同作用改善大鯢的免疫能力，而DNJ作為單體作用效果不如MLE。兩者均具有一定的清除ROS效果，DNJ對ROS清除效果更佳，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加MLE和DNJ均能改善大鯢的生長性能、肝臟功能，提高免疫能力。

② 在改善體組成、肝臟功能方面MLE作用效果優(yōu)于DNJ，而DNJ對ROS清除效果更佳；MLE的整體添加效果優(yōu)于DNJ。