崔國(guó)倩，項(xiàng)艷，曲曉洋，相萍萍，朱粉霞，謝亞萍

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210028)

格雷夫斯病(Graves diseases，GD)，亦稱彌漫性毒性甲狀腺腫，是一種體內(nèi)甲狀腺激素分泌增多的自身免疫性代謝疾病[1]，以彌漫性甲狀腺腫和分泌功能亢進(jìn)為主要特征，為甲狀腺功能亢進(jìn)癥(簡(jiǎn)稱甲亢)最常見的類型，約占甲亢的85%[2]。近年來(lái)，該病呈患病率逐年增多和起病年輕化的趨勢(shì)[3-5]，還與許多潛在的致命疾病如心臟衰竭、心肌梗死、中風(fēng)等密切相關(guān)，甚至?xí)黾幼詺⒓叭蛩劳鲲L(fēng)險(xiǎn)[6-8]。

中醫(yī)根據(jù)GD的臨床癥狀，可將其歸屬于“癭氣”和“癭病”的范疇。關(guān)于GD的發(fā)病病機(jī)，雖各方醫(yī)家持有不同觀點(diǎn)，但多認(rèn)為肝郁及陰虛為其主要病因[9]。臨床表現(xiàn)主要以臟腑氣血功能失調(diào)、肝氣郁結(jié)、經(jīng)脈氣機(jī)阻遏，內(nèi)郁日久而生痰化火、耗損陰津，最終痰氣郁結(jié)交互阻于頸項(xiàng)而發(fā)癭瘤[2]。

GD的臨床治療主要包括抗甲狀腺藥物(Antithyroid drugs，ATDs)、放射性治療和手術(shù)治療，但普遍存在緩解率低、復(fù)發(fā)率高、長(zhǎng)期療效不理想、并發(fā)癥多等問題[10]。為此，尋求更有效的治療方法和藥物迫在眉睫。

瀉火消癭方是江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院應(yīng)用多年的臨床協(xié)定經(jīng)驗(yàn)方，其組成為龍膽、夏枯草、黃芩、生地黃、百合、知母及穿山龍[11]，是在龍膽瀉肝湯的基礎(chǔ)上化裁凝練而成，具有清肝瀉火、滋陰寧心的功效。在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方有助于GD患者甲狀腺功能迅速恢復(fù)，提高疾病恢復(fù)率，減少ATDs的應(yīng)用[12]，但其治療GD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和具體機(jī)制并不清楚，有待進(jìn)一步闡明。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選、預(yù)測(cè)和查找瀉火消癭方的活性化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)蛋白相互作用(PPI)、靶點(diǎn)功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而用分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證，揭示瀉火消癭方治療GD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)(圖1)。

圖1 研究思路

1 材料與方法

1.1 瀉火消癭方中化學(xué)成分的收集

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com)和CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cnki.net/)，收集瀉火消癭方中龍膽草、夏枯草、黃芩、生地黃、百合、知母、穿山龍7味藥材的化學(xué)成分。以口服吸收利用度(Oral bioavailability，OB)≥20%，藥物相似性(Drug likeness，DL)≥0.18作為參數(shù)進(jìn)行篩選，獲取瀉火消癭方的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)集。進(jìn)而通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得每個(gè)化合物的2D結(jié)構(gòu)集；再使用Chem3D 19.0將其轉(zhuǎn)化成mol2文件。利用Discovery Studio(DS)2016軟件對(duì)瀉火消癭方中化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，從而生成瀉火消癭方中化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD的潛在作用靶點(diǎn)篩選

基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(www.swisstargetprediction.ch/)，以Probability值>0.5為參數(shù)篩選靶點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn)提供的靶點(diǎn)信息，反向預(yù)測(cè)瀉火消癭方中化學(xué)成分所作用的潛在靶點(diǎn)。將各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果取并集，并刪除重復(fù)結(jié)果，最終獲得瀉火消癭方中化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)集。

以“Graves diseases”為關(guān)鍵詞，在TTD(http://bidd.nus.edu.sg/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得GD疾病相關(guān)靶點(diǎn)集。

將以上篩選出的瀉火消癭方化學(xué)成分作用靶點(diǎn)集，與尋獲的GD相關(guān)疾病靶點(diǎn)集取交集，即獲得瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD的潛在作用靶點(diǎn)集。通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將交集靶點(diǎn)規(guī)范為人源(Homo Sapiens)的標(biāo)準(zhǔn)基因，作為靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化名稱。

1.3 “藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

標(biāo)識(shí)以上靶點(diǎn)集對(duì)應(yīng)屬性，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1構(gòu)建瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。再將瀉火消癭方中化學(xué)成分的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，物種選擇“Homo Sapiens”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點(diǎn)通路注釋分析

為進(jìn)一步分析瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD的潛在作用靶點(diǎn)集的基因功能以及在信號(hào)通路中的作用，將其官方簡(jiǎn)稱上傳到Matescape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/)，設(shè)定閾值P<0.01，同時(shí)Background選擇“Homo Spanies”，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作，分別進(jìn)行蛋白的GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理[13]。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

利用DS 2016軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接模型，進(jìn)而與瀉火消癭方中篩選出的主要活性化合物，進(jìn)行分子對(duì)接，分析對(duì)接結(jié)果。并與GD陽(yáng)性藥分子比較，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的可靠性。首先在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載瀉火消癭方活性化學(xué)成分治療GD關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，選擇人源受體、解析度小于2.5 ?并具有配體的蛋白復(fù)合物，以保證對(duì)接的精度。采用DS 2016中CleanProtein工具對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)處理，根據(jù)PDB晶體原配體的空間位置定義活性口袋，Conformation method參數(shù)設(shè)置為“Best”，Docking preferences參數(shù)設(shè)置為“High quality”，其余參數(shù)為默認(rèn)。將原配體抽出后重新對(duì)接到蛋白的活性口袋中，根據(jù)對(duì)接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差(RMSD)大小判斷對(duì)接程序參數(shù)設(shè)置的合理性以及對(duì)該晶體復(fù)合物的實(shí)用性，一般認(rèn)為當(dāng)RMSD≤2 ?時(shí)說(shuō)明分子對(duì)接模型能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結(jié)合模式，對(duì)接結(jié)果有較高的可靠性[14]。再將瀉火消癭方中潛在活性成分及抗GD陽(yáng)性藥分子導(dǎo)入DS 2016中進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算對(duì)接打分值(-CDOCKER ENERGY)。

當(dāng)-CDOCKER ENERGY值高于原配體時(shí)，可認(rèn)為成分與靶點(diǎn)具有較高的結(jié)合活性，以此作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與陽(yáng)性藥分子的-CDOCKER ENERGY值對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 化合物及靶蛋白篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到多個(gè)化合物(符合條件OB≥20%，DL≥0.18)，其中龍膽含有17個(gè)成分，夏枯草含有16個(gè)成分，黃芩含有36個(gè)成分，百合含有9個(gè)成分，知母含有15個(gè)成分以及穿山龍含有4個(gè)成分成分。對(duì)于生地黃，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)不能檢索到其化合物，我們通過查閱文獻(xiàn)，得到生地黃中的化學(xué)成分[15-17]，進(jìn)而在TCMSP網(wǎng)站中查看其OB值和DL值，最終有7個(gè)化學(xué)成分符合條件，因此，選擇這7個(gè)化合物作為生地黃的主要成分。知母中的芒果苷和知母皂苷BⅡ是2020年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定的指標(biāo)性成分，但是在TCMSP網(wǎng)站中未檢索到芒果苷的OB值和DL值，檢索到知母皂苷BⅡ的OB值和DL值分別為3.11和0.04，因其比較重要，亦將其添加上[18]。去掉7個(gè)重復(fù)成分(齊墩果酸、異葒草素、β-谷甾醇、山柰酚、西托糖苷、植物甾醇和豆甾醇葡萄糖苷)。因此，共確定瀉火消癭方化學(xué)成分92個(gè)。

收集到的化學(xué)成分較多，因此對(duì)其進(jìn)行一個(gè)分類分析。圖2的圓環(huán)圖表明，瀉火消癭方中化學(xué)成分主要集中在黃酮類，其次分別是萜類、甾體和生物堿等。

圖2 瀉火消癭方中化學(xué)成分的主要結(jié)構(gòu)類型

2.2 瀉火消癭方化學(xué)成分治療GD潛在作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

在DrugBank、PharmMapper及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)上傳92個(gè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息，獲取其作用靶點(diǎn)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的人源靶點(diǎn)進(jìn)行匯總并去除重復(fù)靶點(diǎn)，最終獲得與瀉火消癭方化學(xué)成分相關(guān)的人源靶點(diǎn)1 154個(gè)。

以“Graves diseases”為關(guān)鍵詞，利用TTD、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，去重以后共獲得GD相關(guān)靶點(diǎn)1 467個(gè)。

將瀉火消癭方中化學(xué)成分作用的1 154個(gè)潛在作用靶點(diǎn)映射到1 467個(gè)GD靶點(diǎn)集中，最終獲得瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點(diǎn)為227個(gè)(圖3)。其中君藥龍膽化學(xué)成分共占154個(gè)靶點(diǎn)，臣藥夏枯草和黃芩分別占121、160個(gè)靶點(diǎn)，佐藥生地黃、百合、知母和穿山龍分別占71、114、149、68個(gè)靶點(diǎn)。

圖3 瀉火消癭方反向找靶及治療GD潛在作用靶點(diǎn)研究

2.3 構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

借用Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，可以直觀顯示7味中藥成分和靶點(diǎn)的關(guān)系及其重要性。如圖4所示，圖中共有326個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 924條網(wǎng)絡(luò)。度值(Degree)是指連接該節(jié)點(diǎn)的邊的數(shù)量，連接該點(diǎn)的邊越多，度值越大，說(shuō)明與該點(diǎn)相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)越復(fù)雜[13]。在軟件中設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小與顏色反映Degree的變化，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，則Degree越大，從而構(gòu)建瀉火消癭方對(duì)GD的潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

從圖4可看出，成分中Degree最大的是植物甾醇(E1，Degree=132)，其次是西托糖苷(D1，Degree=120)、β-谷甾醇(B1，Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(F1，Degree=80)、山柰酚(C1，Degree=72)、齊墩果酸(A1，Degree=68)和異葒草素(A2，Degree=65)，均為重復(fù)成分。以Degree為依據(jù)進(jìn)行靶點(diǎn)排序，前15位靶點(diǎn)分別為CA2、CA1、ESR2、MET、EGFR、SRC、FLT3、PTGS2、ESR1、ABCB1、IGF1R、MMP9、MMP3、PIK3CG、NOX4。

圖4 瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的227個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)構(gòu)建PPI表。利用Cytoscape進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，同時(shí)利用Cytoscape模塊分析功能進(jìn)行聚類分析，從而得到最佳模塊。如圖5所示，將最佳功能模塊分為模塊一(MCODE-1)、模塊二(MCODE-2)、模塊三(MCODE-3)、模塊四(MCODE-4)、模塊五(MCODE-5)、模塊六(MCODE-6)。

圖5 瀉火消癭方干預(yù)GD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)中PPI靶點(diǎn)有227個(gè)，2 935條邊代表了蛋白之間相互作用關(guān)系。通過10種計(jì)算方法(MCC、Degree、MNC、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress)，選出各方法計(jì)算出的前50位靶點(diǎn)，并取其交集，分別是EGFR、SRC、JUN、HSP90AA1、TP53、HSPA1A、MAPK3、GRB2、STAT3、ESR1、MAPK14、PIK3R1、CTNNB1、HPSAS、HDAC1、PARP1、HDAC2、CCND1，推測(cè)以上18個(gè)靶點(diǎn)可能是瀉火消癭方治療GD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 模塊化分析

再將獲得的227個(gè)瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用分子復(fù)合物檢測(cè)(MCODE)算法來(lái)識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)，按照P值將PPI網(wǎng)絡(luò)劃分得到最佳功能模塊，具體結(jié)果如圖6。

圖6 PPI模塊分析

其中MCODE-1為圖7中的紅色節(jié)點(diǎn)，主要參與癌癥通路(Pathways in cancer)、Rap1信號(hào)通路(Rap1 signaling pathway)；MCODE-2為圖7中的藍(lán)色節(jié)點(diǎn)，主要參與癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥中蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)；MCODE-3為圖7中綠色節(jié)點(diǎn)，主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)；MCODE-4為圖7中紫色節(jié)點(diǎn)，主要參與甲型流感(Influenza A)；MCODE-5為圖7中橙色節(jié)點(diǎn)，主要參與胰島素抵抗(Insulin resistance)、mTOR信號(hào)通路(mTOR signaling pathway)；MCODE-6為圖7中黃色節(jié)點(diǎn)，主要參與TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)。

圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 靶蛋白生物分析結(jié)果

通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)瀉火消癭方與GD交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析和GO富集分析，獲得靶基因參與的通路和生物過程。結(jié)果顯示，通過對(duì)成分靶蛋白進(jìn)行生物分析,共得到KEGG通路192條(P<0.05)，根據(jù)通路P值，結(jié)合生物學(xué)信息，選取P值相對(duì)較小且靶點(diǎn)富集的20條生物學(xué)過程。

以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中富集得到的通路信息繪制KEGG通路氣泡圖，結(jié)果見圖8。發(fā)現(xiàn)癌癥通路(Pathways in cancer)、弓形蟲病(Toxoplasmosis)、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)、利什曼病(Leishmaniasis)、人T細(xì)胞白血病病毒1感染(Human T-cell leukemia virus 1 infection)等生物學(xué)過程，在瀉火消癭方治療GD中發(fā)揮重要作用。

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

將KEGG富集結(jié)果與瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖9所示，其中粉紫色正方形代表信號(hào)通路，大小代表-logP值。

圖9 瀉火消癭方成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

GO功能富集分析得到GO條目2 385個(gè)(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目1 988個(gè)，細(xì)胞組成(CC)條目255個(gè)，分子功能(MF)條目142個(gè)，選取P值相對(duì)較小且靶點(diǎn)富集的20條BP條目繪制GO條目柱狀圖，如圖10所示。BP富集到的條目主要為細(xì)胞遷移正向調(diào)控(Positive regulation of cell migration)、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of cell migration)、對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to organic cyclic compound)、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控(Regulation of MAPK cascade)、對(duì)氮化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to nitrogen compound)、白細(xì)胞與細(xì)胞黏附(Leukocyte cell-cell adhesion)、循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)程(Circulatory system process)等；CC主要富集到膜筏(Membrane raft)、膜面(Side of membrane)、細(xì)胞的頂端部分(Apical part of cell)、受體復(fù)合體(Receptor complex)、囊泡腔(Vesicle lumen)、溶泡(Lytic vacuole)、黑素體(Melanosome)等；MF主要富集到激酶結(jié)合(Kinase binding)、蛋白激酶活性(Protein kinase activity)、核受體活性(Nuclear receptor activity)、趨化因子結(jié)合(Chemokine binding)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(Protein domain specific binding)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性(Protein tyrosine kinase activity)、脂質(zhì)結(jié)合(Lipid binding)等。

圖10 GO分析結(jié)果

2.7 關(guān)聯(lián)性分析

將Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行連接，采用文本挖掘技術(shù)對(duì)疾病、復(fù)雜疾病和環(huán)境性疾病進(jìn)行了相關(guān)性分析?；蚪M中的所有基因均已用作富集背景，收集P<0.01，最小計(jì)數(shù)為3和富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計(jì)數(shù)與偶然預(yù)期的計(jì)數(shù)之間的比率)的術(shù)語(yǔ)，并根據(jù)其成員相似度將其分組。

結(jié)果如圖11所示，從圖中可看出上述篩出的瀉火消癭方的227個(gè)靶點(diǎn)與GD具有緊密的關(guān)聯(lián)性，GD排在首位，之后依次為腹主動(dòng)脈瘤(Aortic aneurysm，abdominal)、心肌缺血(Myocardial ischemia)、實(shí)驗(yàn)性糖尿病(Diabetes mellitus，experimental)、肺部疾病(Lung diseases)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy)等。此可證明篩出的227個(gè)靶點(diǎn)與其他疾病靶點(diǎn)具有重合靶點(diǎn)，可推測(cè)GD與其他疾病具有并發(fā)關(guān)系。GD病癥常伴有心血管功能紊亂、呼吸功能異常、肝功能損害等表現(xiàn)，特殊情況主要包括Graves眼病、甲亢性心臟病以及周期性麻痹等[2]，以上現(xiàn)象均可證明GD與計(jì)算出的各個(gè)疾病具有緊密關(guān)聯(lián)。

圖11 瀉火消癭方與疾病的關(guān)聯(lián)分析

進(jìn)一步從發(fā)育、分化等方面探索227個(gè)靶點(diǎn)與各個(gè)細(xì)胞、組織的關(guān)聯(lián)性，從圖12中可發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方與HEPG2、HUVEC、DRG、心肌細(xì)胞等特異性細(xì)胞和肺、脾臟、骨髓、腎臟、肝臟等特異性組織，均具有緊密聯(lián)系。這與上文闡述的GD病變涉及五臟形成對(duì)應(yīng)，證明了瀉火消癭方對(duì)GD的治療作用。

圖12 瀉火消癭方與細(xì)胞、組織的關(guān)聯(lián)分析

2.8 分子對(duì)接結(jié)果

為驗(yàn)證本研究網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，以“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的Degree為依據(jù)進(jìn)行化學(xué)成分排序，選取前29位化學(xué)成分；將瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)與瀉火消癭方干預(yù)GD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖計(jì)算出的關(guān)鍵靶點(diǎn)相結(jié)合，對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行搜索，最終有14個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的配體與受體可用，所以選取這14個(gè)靶點(diǎn)作為分子對(duì)接的關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2及MET；將化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)建立分子對(duì)接模型，將原配體從活性口袋中抽離并重新對(duì)接，計(jì)算對(duì)接后的RMSD及-CDOCKER ENERGY值。

結(jié)果顯示,SRC、JUN、HSP90AA1、ESR1、HSPA1A、MAPK14、PIK3R1、PARP1、ESR2、IGF1R、PIK3CG、TOP2A、F2、MET分子對(duì)接模型RMSD值分別為0.775 9、0.568 4、0.562 4、0.856 8、0.776 2、0.512 0、0.641 0、1.210 2、0.624 4、0.660 4、0.524 6、0.727 8、0.669 1、1.070 5 ?，均小于2 ?，認(rèn)為能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結(jié)合模式，對(duì)接結(jié)果具有較高可靠性，靶點(diǎn)具體信息見表1，靶點(diǎn)對(duì)接模型見圖13。

表1 靶點(diǎn)信息

圖13 靶點(diǎn)對(duì)接模型

將上述14個(gè)靶點(diǎn)與29個(gè)潛在活性成分及3個(gè)治療GD的陽(yáng)性藥成分甲亢平(Y1)、丙硫氧嘧啶(Y2)、甲硫咪唑(Y3)，進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)果如表2所示。各靶點(diǎn)與陽(yáng)性藥分子對(duì)接結(jié)果顯示，瀉火消癭方中部分潛在活性成分與靶點(diǎn)-CDOCKER ENERGY值大于Y1、Y2、Y3與靶點(diǎn)結(jié)合的-CDOCKER ENERGY值，表明瀉火消癭方的活性化學(xué)成分作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥。結(jié)合上述結(jié)果，瀉火消癭方中的成分與潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，提示瀉火消癭方中藥材可能通過作用于潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)產(chǎn)生抗GD的作用。

表2 對(duì)接結(jié)果

3 討論

3.1 瀉火消癭方治療GD潛在有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及可能作用機(jī)制

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)調(diào)研，基于已定化合物的OB和DL值，得出92個(gè)成分，重復(fù)成分有7個(gè)。篩選出瀉火消癭方治療GD的潛在作用靶點(diǎn)為227個(gè)。將以上收集的成分與靶點(diǎn)構(gòu)建瀉火消癭方“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。本研究中，以Degree網(wǎng)絡(luò)特征為依據(jù)并進(jìn)行分析，得出瀉火消癭方治療GD潛在有效成分排序表，進(jìn)而以Degree值中位數(shù)的2倍(Degree=30)為界限，篩選出瀉火消癭方治療GD潛在有效成分29個(gè)和潛在靶點(diǎn)14個(gè)。

本研究由網(wǎng)絡(luò)分析獲得的29個(gè)瀉火消癭方治療GD的潛在有效成分，包括植物甾醇、西托糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇葡萄糖苷、山柰酚、齊墩果酸、異葒草素、薯蕷皂苷和迷迭香酸等成分。文獻(xiàn)報(bào)道異葒草素可通過干擾癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)控活性氧水平等多種途徑實(shí)現(xiàn)抗癌目的[19]，熊果酸可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及影響腫瘤組織的血管生成[20]，以上作用與KEGG富集得到的通路信息癌癥通路(Pathways in cancer)結(jié)果一致；在對(duì)紅景天苷的研究中得知其可通過調(diào)控Nrf2的表達(dá)逆轉(zhuǎn)由AGE引起的HK-2細(xì)胞凋亡以及糖尿病導(dǎo)致的腎臟組織損傷[21]，這一作用與通路信息糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)息息相關(guān)；在對(duì)齊墩果酸研究中發(fā)現(xiàn)其會(huì)使大鼠的血清甲狀腺素[Thyroxin(e)]水平降低和促甲狀腺素(TSH)水平升高[22]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元能顯著降低GD大鼠FT3、FT4水平[23]，此外迷迭香酸可抑制細(xì)胞自噬[24]，但都無(wú)法確定其具體機(jī)制?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)其他成分的報(bào)道較少，其抗GD的藥效及作用機(jī)制研究，同樣值得進(jìn)一步研究。

本研究針對(duì)由網(wǎng)絡(luò)分析獲得的14個(gè)瀉火消癭方治療GD的作用靶點(diǎn)進(jìn)行討論，ESR1通過甲狀腺激素通路參與DNA相互作用轉(zhuǎn)錄表達(dá)，該基因編碼雌激素受體[25]；ESR2是屬于NR3亞家族核激素受體家族的核蛋白，是一種核激素受體，與雌激素的親和力類似于ESR1；IGF1R是激素胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的細(xì)胞表面受體；MAPK1是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)中有重要作用[26]；當(dāng)細(xì)胞在負(fù)面狀態(tài)下，MAPK通路被激活，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面的改變[27]；MET基因編碼的蛋白為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)，與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)，參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控，是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要因素。以上靶點(diǎn)提示瀉火消癭方可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素分泌水平、激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)抗炎反應(yīng)、加強(qiáng)細(xì)胞分化和凋亡機(jī)制從而起到治療GD的效果。

此外，對(duì)KEGG和GO得到的結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，瀉火消癭方或許能夠?qū)Χ喾N癌癥有所影響。其中KEGG條目有癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥中心碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等；GO分析得到細(xì)胞遷移正向調(diào)控(Positive regulation of cell migration)、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of cell migration)、對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to organic cyclic compound)、對(duì)氮化合物的細(xì)胞應(yīng)答(Cellular response to nitrogen compound)等條目，可推測(cè)瀉火消癭方或許能夠干預(yù)多種癌癥的進(jìn)程，但詳細(xì)的作用機(jī)制有待于后期研究。

3.2 從分子層面分析瀉火消癭方的配伍機(jī)制

GD病變涉及心、肝、脾三臟，肝郁化火，則見肝火亢旺。母病及子，致心火亢盛。肝木乘脾，脾失健運(yùn)，釀生痰濕，痰氣交阻，血行不暢，氣、血、痰壅結(jié)頸前，痰氣郁結(jié)化火，終致心肝火旺。瀉火消癭方重用君藥龍膽清瀉肝膽實(shí)火，清利肝經(jīng)濕熱，臣以夏枯草、黃芩增強(qiáng)君藥清肝瀉火之力，切合前述GD肝火旺盛的病機(jī)。GD損傷肝陰的同時(shí)，也會(huì)傷及心陰，出現(xiàn)心悸、煩躁、脈數(shù)等癥。故用生地黃、百合、知母滋陰養(yǎng)血，以使標(biāo)本兼顧，其中知母既善降火，又能滋陰。反佐穿山龍既防君臣寒涼太過，又防陰傷血澀之變。全方共奏清肝瀉火、滋陰寧心之功[12]。

為了進(jìn)一步闡述瀉火消癭方的配伍機(jī)制，對(duì)前文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出的化學(xué)成分藥效Degree排序，并進(jìn)行分析(見圖4)，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分分布情況與復(fù)方藥材配伍有極大的相關(guān)性。龍膽中有12個(gè)化學(xué)成分排在前30位，說(shuō)明其在瀉火消癭方中發(fā)揮了君藥的重要作用。再以Degree的中位數(shù)(Degree=27)為限，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行分析，君藥龍膽，臣藥夏枯草和黃芩的化學(xué)成分較多，龍膽有13個(gè)化學(xué)成分，夏枯草有13個(gè)化學(xué)成分，黃芩有22個(gè)化學(xué)成分，而生地黃、百合、知母、穿山龍分別有3、6、6、1個(gè)化學(xué)成分。推測(cè)龍膽為關(guān)鍵藥材，夏枯草與黃芩對(duì)龍膽具有協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)和加強(qiáng)其對(duì)GD的治療，生地黃、百合、知母及穿山龍對(duì)治療GD起輔助補(bǔ)充之效。有文獻(xiàn)證明夏枯草多糖影響GD小鼠甲狀腺激素的合成和分泌[28]；同時(shí)，近期研究發(fā)現(xiàn)瀉火消癭方中的重要成分黃芩苷可通過抑制mTOR信號(hào)通路重塑Tfh/Tfr細(xì)胞的平衡[29]；文獻(xiàn)報(bào)道表明甲亢初期加用百合能夠降低Thyroxin(e)水平[30]；知母主要成分知母皂苷能降低異常升高的β受體濃度，降低甲狀腺激素對(duì)CAMP的激活作用[31]；且穿山龍主要成分薯蕷皂苷元可以緩解甲狀腺腫大癥狀[32]。以上文獻(xiàn)可證明復(fù)方中的藥材可在多方面緩解GD，從而改善GD病況。

夏枯草化學(xué)成分中包含7個(gè)重復(fù)的化學(xué)成分，即存在較多重復(fù)的分子作用靶點(diǎn)，或可說(shuō)明其作為臣藥輔助龍膽可加強(qiáng)對(duì)GD的治療作用。黃芩化學(xué)成分含量占比第一(36/104)，分子作用靶點(diǎn)最多(160)，其中有17個(gè)靶點(diǎn)為黃芩所獨(dú)有的，說(shuō)明此藥是對(duì)瀉火消癭方作用靶點(diǎn)的擴(kuò)充。百合和知母化學(xué)成分包含全方中Degree最大的植物甾醇(Degree=132)，且無(wú)特有靶點(diǎn)，或可說(shuō)明其在治療GD中，起到增強(qiáng)君藥與臣藥療效的功用。

由成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖4)可知重復(fù)成分具有較大Degree的化學(xué)成分，包括植物甾醇(Degree=132)、西托糖苷(Degree=120)、β-谷甾醇(Degree=107)、豆甾醇葡萄糖苷(Degree=80)、山柰酚(Degree=72)、齊墩果酸(Degree=68)和異葒草素(Degree=65)，同時(shí)也是對(duì)接較好的成分(表2)。由此可得，單個(gè)成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，或多個(gè)成分作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)出中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。且復(fù)方中藥材成分相互重合，推測(cè)在合理配伍之后，利用其相互間的協(xié)同作用，可提高療效或減少不良反應(yīng)，適應(yīng)復(fù)雜病情的治療。

由前述研究可知，瀉火消癭方中7味中藥所含共同靶點(diǎn)為227個(gè)，其中君藥龍膽占154個(gè)，臣藥夏枯草和黃芩在共同靶點(diǎn)中分別占121、160個(gè)，佐藥生地黃、百合、知母和穿山龍分別占71、114、149、68個(gè)。表明7味藥材具有大量的重疊靶點(diǎn)，說(shuō)明復(fù)方藥材通過增強(qiáng)共同靶點(diǎn)的作用而改善GD病癥，揭示了復(fù)方用藥的原理。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，通過計(jì)算機(jī)挖掘網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)方法對(duì)瀉火消癭方進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和通路分析，并對(duì)其活性成分的抗GD作用機(jī)制進(jìn)行探究。同時(shí)借助分子對(duì)接技術(shù)對(duì)瀉火消癭方的核心成分與治療GD潛在靶點(diǎn)的結(jié)合能力進(jìn)行研究，從而明確瀉火消癭方的主要調(diào)控靶點(diǎn)，提示臨床用該方治療GD的合理性，為其后續(xù)療效評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選提供依據(jù)和方向。