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      PD-1在急性白血病異基因造血干細胞移植后T淋巴細胞的表達

      2021-03-31 02:34:36劉建寧牛志云溫樹鵬張學(xué)軍王福旭
      臨床薈萃 2021年3期
      關(guān)鍵詞:受者白血病淋巴細胞

      劉建寧, 孫 立, 牛志云, 溫樹鵬, 王 穎, 張學(xué)軍, 王福旭

      (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科;河北省血液病重點實驗室, 河北 石家莊 050000)

      異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)通過移植物抗白血病效應(yīng)(graft-versus-leukemia, GVL)實現(xiàn)了對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治愈效果,執(zhí)行GVL的供者T淋巴細胞經(jīng)歷活化擴增及效應(yīng)的過程后清除白血病細胞,成為中高危急性白血病(acute leukemia,AL)有效的治療手段。而移植后復(fù)發(fā)是allo-HSCT后最常見的死亡原因。一旦復(fù)發(fā),預(yù)后很差,總體5年生存率僅為5%[1-2]。目前針對復(fù)發(fā)的治療手段有:調(diào)整免疫抑制劑、補救性放療化療、去甲基化藥物治療、細胞治療、靶向治療等[3]。這些方案能起到一定程度上的改善效果,但結(jié)果仍不理想。白血病復(fù)發(fā)的可能原因包括白血病細胞的耐藥機制,其生物學(xué)特性出現(xiàn)改變,對GVL效應(yīng)不敏感從而實現(xiàn)免疫逃逸;也有研究表明白血病細胞丟失了不相合的HLA單倍體表型,導(dǎo)致主要或次要組織相容性復(fù)合體表達降低,不被免疫細胞識別從而復(fù)發(fā);而腫瘤通過激活以程序性死亡蛋白1(PD-1)為代表的免疫檢查點轉(zhuǎn)導(dǎo)的負調(diào)控通路來抑制免疫反應(yīng)逃避免疫的機制愈受重視。PD-1是表達于T淋巴細胞的免疫抑制性受體,腫瘤細胞浸潤的T淋巴細胞PD-1的表達突出明顯,活化的T淋巴細胞經(jīng)抗原識別后表達PD-1,并分泌干擾素,誘導(dǎo)組織中其配體(programmed death ligand-1,PD-L1)的表達,腫瘤細胞表達PD-L1與PD-1結(jié)合,抑制T淋巴細胞功能。本研究收集2019年3月至2020年2月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院行allo-HSCT患者40例的臨床資料,同期健康者23例,動態(tài)比較兩組T淋巴細胞PD-1的表達水平,重點分析移植后患者T淋巴細胞表面PD-1表達水平變化及臨床意義,以便為后期治療提供參考,報道如下。

      1 資料與方法

      1.1研究對象 本研究所觀察患者組病例均來自2019年3月至 2020年2月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院行allo-HSCT患者40例,男21例,女19例,平均年齡(33.30±10.67)歲;急性髓細胞白血病(AML)21例,急性淋巴性細胞白血病(ALL)16例,慢性粒細胞白血病(CML)加速期 1例,急性混合細胞白血病(MPAL)2例。同期健康志愿者23例,設(shè)為健康對照組,其中男性15例,女性8例,平均年齡(45.65±10.40)歲。所有患者均通過細胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)及細胞遺傳學(xué)等檢查確診,符合惡性血液病診斷標(biāo)準[4]。研究均獲得患者的知情同意并簽署知情同意書,符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

      1.2移植情況 移植患者移植前原發(fā)病危險分層:高危17例,中危16例,低危7例[5-6]。移植均為親緣供者,其中人類白細胞抗原(HLA)全相合12例,單倍型相合28例。干細胞來源:外周血干細胞(PBSC)10例,因國內(nèi)外研究表明采用臍帶血等第三方細胞輔助allo-HSCT等促進供者造血干細胞植入,降低GVHD發(fā)生率,減少復(fù)發(fā)死亡率,改善allo-HSCT預(yù)后[7-9],故研究對象中有30例患者干細胞源于PBSC+臍帶血(CB)。血型相合20例,血型不合20例,供受者性別相同22例,不同18例。

      1.3預(yù)處理方案 均采用清髓預(yù)處理方案,劑量均遵從中國allo-HSCT治療血液系統(tǒng)疾病專家共識(I)[10]。見表1。

      表1 移植患者組清髓預(yù)處理方案

      1.4干細胞動員、采集及回輸 動員應(yīng)用重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)皮下注射,rhG-CSF(5-10 μg/kg·d),4~7天。第4~7天采集外周血干細胞,采集目標(biāo)為MNC≥5×108/kg受者體重,CD34+細胞≥2×106/kg受者體重。本研究患者回輸細胞情況為MNC中位數(shù)9.883(7.199, 13.261)×108/kg受者體重,CD34+細胞中位數(shù)4.434(3.621, 5.795)×106/kg受者體重。

      1.5植入情況 移植效果以造血干細胞回輸后連續(xù)3天中性粒細胞計數(shù)>0.5×109/L的第1天為粒細胞植入;不依賴血小板連續(xù)輸注7天血小板計數(shù)>20×109/L的第1天為血小板植入。

      1.6移植物抗宿主病(GVHD)的診斷與治療 移植后急性、慢性移植物抗宿主病參照NIH 2005[11]、NCI 2011[12]標(biāo)準進行診斷和評估。GVHD的常規(guī)預(yù)防采用環(huán)孢素A(CsA)+嗎替麥考酚酯(MMF)+短療程甲氨蝶呤(MTX)+蘆可替尼,CsA起始劑量1.5 mg/kg每12小時1次,靜脈輸注,-1天開始,消化道癥狀消失后改為口服,一般移植后3個月逐漸減量,6個月停用,根據(jù)復(fù)發(fā)風(fēng)險和GVHD情況酌情縮短或延長其應(yīng)用時間,MTX于+1、+3、+6天給藥,并于用藥24小時后給予甲酰四氫葉酸鈣解救,個別患者給予預(yù)防性供者淋巴細胞輸注(DLI)。GVHD的治療首先根據(jù)環(huán)孢素濃度適當(dāng)調(diào)整CsA用量,同時給予甲潑尼龍1~2 mg/kg,若病情3天后進展或5~7天后未緩解,考慮給予MTX、注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白、抗CD25單克隆抗體等二線藥物治療[13]。

      1.7病情監(jiān)測 分別于移植后1、2、3、4.5、6個月留取患者外周血、骨髓,進行血常規(guī)、骨髓細胞形態(tài)學(xué)、微小殘留檢測、融合基因、細胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等檢測,骨髓、外周血供受者DNA嵌合、性染色體錯配的監(jiān)測,以評估患者疾病狀態(tài)。微小殘留檢測采用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體及流式細胞儀檢測細胞抗原的表達及表達量,本研究MRD陽性復(fù)發(fā)的患者6例,其中,AML 3例、B-ALL 1例、T-ALL 1例、MPAL 1例,分別于移植后0.5、1.5、9、17、2、3個月復(fù)發(fā),同時留取外周血標(biāo)本監(jiān)測PD-1的表達水平。

      1.8PD-1檢測 實驗所需試劑均購于Biolegend公司,應(yīng)用流式細胞儀(品牌:美天旎,型號:MACSQuant 10)檢測外周血標(biāo)本PD-1在CD3+CD4+, CD3+CD8+T淋巴細胞的表達水平。各取100 ul抗凝處理后全血加入到2個EP管中,向管1中加入2 ul CD8 Pacific Blue(貨號301033)、PD1-FITC(貨號329904)、CD4-PE/CY7(貨號300512)、CD3-APC/CY7(貨號300426)、7AAD(貨號420404),管2中加入同型對照CD8 Pacific Blue、IgG1-FITC(貨號78080)、CD4-PE/CY7、CD3-APC/CY7、7AAD混勻,于4℃環(huán)境下避光孵育10 min;離心后棄上清液,并加入裂解液混勻,室溫避光10-15 min以裂解紅細胞。裂解后離心棄上清,加入FBS,重懸細胞,上機檢測。應(yīng)用Flowjo軟件分析:圈定細胞門P1門后,在P1門內(nèi)設(shè)置CD3/SSC顯示CD3占所有有核細胞的比例;在CD3門內(nèi),以“十字門”的方式畫出CD4+PD1+/CD4-PD1+細胞;另外再在CD4門和CD8門內(nèi)以畫出PD-1+細胞的比例。

      2 結(jié) 果

      2.1移植后PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞的表達水平變化 移植后1~6個月PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002),且表達水平呈現(xiàn)逐漸下降的變化。見表2、圖1。

      表2 PD-1在T淋巴細胞的表達水平

      圖1 移植組PD-1表達水平隨移植后時間的變化

      2.2移植組1~6個月與對照組PD-1的表達水平比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后1~6個月PD-1在CD3+CD4+T細胞的表達水平逐漸下降,但均高于對照組,移植后表達水平最低的第6個月和對照組PD-1的表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=54.000,P=0.003);移植組PD-1在CD3+CD8+T細胞的表達水平在移植后1、2個月高于對照組(U=44.000,P<0.01),移植后3、4.5、6個月CD3+CD8+T細胞和對照組PD-1的表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=115.000,125.000,110.000,P=0.267,0.434,0.202)。

      2.3PD-1表達水平對MRD陽性復(fù)發(fā)的提示意義 根據(jù)34例MRD陰性組患者T淋巴細胞PD-1的表達數(shù)據(jù),分別統(tǒng)計移植后1、2、3、4.5及6個月不同時間點表達水平的均值范圍。本研究中MRD陽性復(fù)發(fā)患者6例,其中4例未于MRD陽性復(fù)發(fā)前采樣檢測均不納入統(tǒng)計,1例復(fù)發(fā)患者在MRD復(fù)發(fā)前曾行DLI治療,PD-1表達水平低于未DLI組,故未納入MRD陽性組分析,剩余1例患者復(fù)發(fā)前3個月(移植后6個月)PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞的表達水平54.20%;37.30%,高于總體均值范圍(29.27±15.08)%;(17.18±17.50)%。

      3 討 論

      allo-HSCT作為治愈AL的主要治療方案,移植物存在抗白血病效應(yīng)(GVL)是造血干細胞移植能夠治愈AL的主要機制。而移植后復(fù)發(fā),嚴重影響著移植后患者的長期生存時間和狀態(tài),可能由GVL效應(yīng)丟失導(dǎo)致。目前研究分析GVL效應(yīng)丟失的原因:①白血病細胞HLA Ⅱ類分子丟失;②白血病細胞獲得新的基因突變;③T淋巴細胞PD-1表達上調(diào);④白血病細胞PD-L1表達升高。

      PD-1作為CD28家族的成員之一,表達于T淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞,通過與其配體PD-L1相互作用引起T細胞衰竭而發(fā)揮負性免疫調(diào)控效應(yīng)[14]。其轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號通路干擾T細胞的活化和增殖,使T細胞處于衰竭狀態(tài),免疫細胞功能差,抑制性受體持續(xù)表達,妨礙免疫系統(tǒng)對感染和腫瘤細胞的最佳控制[15]。Simonetta等[16]分析了105例allo-HSCT受者分離的T細胞亞群上PD-1的表達,結(jié)果顯示allo-HSCT后表達PD-1的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的比例在移植后早期明顯增加,且PD-1在CD3+CD8+T細胞表面的表達只呈現(xiàn)了一過性增加,隨時間推移逐漸趨于正?;贑D3+CD4+T細胞表面的表達呈現(xiàn)早期和長期的增加,雖有下降趨勢,但在研究的所有時間點中(包括allo-HSCT后5年以上的患者),其表達比例仍明顯高于健康對照水平。本研究顯示,allo-HSCT后1個月到6個月PD-1在CD3+CD4+T細胞的表達一直處在高于健康者的水平,但有明顯的下降趨勢;而在CD3+CD8+T細胞的表達雖然也呈下降趨勢,但在3個月開始,與健康者水平差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義,與之前報道吻合。表明allo-HSCT后PD-1在CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞表面的表達變化過程不同,CD3+CD4+T細胞表面PD-1表達上調(diào)持續(xù)時間相對長,不除外持續(xù)性升高,需延長研究時間證實;而CD3+CD8+T細胞表面PD-1則呈現(xiàn)瞬時過表達的特點。

      同時Kong等[17]研究了allo-HSCT的AML患者11例外周血樣本并進行流式細胞術(shù)檢測,其中5例在移植后2~6個月出現(xiàn)白血病復(fù)發(fā),余6例在采血點(移植后3~6個月)一直處于緩解狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)患者中始終檢測到高表達PD-1的細胞比例增加,提示PD-1在allo-HSCT后白血病復(fù)發(fā)中有著預(yù)測價值。Noviello等[18]研究了PD-1等抑制性受體在32例AML患者的骨髓浸潤T細胞的表達在allo-HSCT后復(fù)發(fā)或完全緩解后的差異,發(fā)現(xiàn)移植后復(fù)發(fā)的患者PD-1在CD3+CD8+T細胞表達的比例均高于緩解的患者。本研究中分析復(fù)發(fā)患者復(fù)發(fā)前PD-1表達水平與對應(yīng)移植后時間點未復(fù)發(fā)患者組表達水平的總體均值,發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)前PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞的表達水平高于未復(fù)發(fā)總體的現(xiàn)象。如報道所言,PD-1表達上調(diào),其介導(dǎo)的信號通路抑制T淋巴細胞的功能活化,減少T淋巴細胞的增殖,增加T細胞功能缺陷。以此可推測,當(dāng)移植后患者PD-1檢測表達升高時,衰竭T細胞增加,機體免疫下降,從而促進腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視,導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。

      基于以上研究,目前PD-1抑制劑在allo-HSCT后患者的治療中應(yīng)用逐漸增多。Berger等[19]在pidilizumab的I期臨床試驗中,應(yīng)用于8例AML晚期患者,其中4例曾行allo-HSCT,1例于口服pidilizumab第21天外周幼稚細胞從50%降至5%,提示PD-1抑制劑的抗腫瘤效果。Ravandi等[20]曾在對AML患者的治療中應(yīng)用nivolumab,44例患者中有42例AML患者,2例MDS高危患者,給予患者誘導(dǎo)化療的同時,在第1~3天使用nivolumab,3 mg/kg,應(yīng)答者接受最多5個鞏固周期或行allo-HSCT,結(jié)果顯示44例患者中34例(78%)患者達到完全緩解(CR)或部分緩解(CRi),其中在應(yīng)答時有微小殘留病的16例患者中9例(56%)給予了nivolumab維持治療并在1~3個月后微小殘留病轉(zhuǎn)為陰性。然而,PD-1抑制劑應(yīng)用有效的同時,GVHD似乎也有所增加或加重的可能。Ravandi等[20]研究的44例患者中18例行allo-HSCT,其中13例(Ⅰ~Ⅱ級8例,Ⅲ~Ⅳ級5例)發(fā)生aGVHD。Haverkos等[21]對接受PD-1抑制劑治療的31例allo-HSCT后復(fù)發(fā)的淋巴瘤患者進行了多中心回顧性分析,病例中8例(26%)死亡患者與抗PD-1治療后新發(fā)GVHD有關(guān),17例(55%)在開始使用抗PD-1后出現(xiàn)治療應(yīng)急型GVHD(6例急性,4例重疊,7例慢性),9例為Ⅲ~Ⅳ級的急性或重度慢性GVHD,表明PD-1抑制劑治療可能并發(fā)嚴重和難治的GVHD。雖然也有惡性腫瘤移植后復(fù)發(fā)的早期臨床試驗中,未發(fā)現(xiàn)ipilimumab治療會誘發(fā)或加劇GVHD[22];Simonetta等[16]在分析T細胞表面PD-1的表達與移植后并發(fā)癥的關(guān)系時,也未檢測到aGVHD患者CD4+、CD8+T細胞上PD-1的表達有顯著差異,表明GVHD對allo-HSCT后T細胞上PD-1表達的影響很小。但PD-1抑制劑的臨床應(yīng)用在令研究者懷有希望的同時因是否直接影響GVHD的發(fā)生而受阻,如何分離GVL效應(yīng)和GVHD,在加強GVL效應(yīng)的同時最大程度的減少或減輕GVHD還需進一步研究,如聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑、減少應(yīng)用劑量等。

      綜合文獻及研究結(jié)果,急性白血病患者移植后早期PD-1在CD3+CD4+T淋巴細胞的表達較正常水平升高且隨移植時間呈現(xiàn)下降趨勢;在CD3+CD8+T淋巴細胞的表達于移植后早期呈現(xiàn)一過性升高。早期應(yīng)用免疫抑制劑可能會減少復(fù)發(fā),但對GVHD的相關(guān)性及預(yù)防需進一步研究。

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