紫蘇籽肽對環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠的改善作用

李明亮，姜 盛，郭 穎，陳 亮，王雨辰，蔡木易，谷瑞增，魏 穎,

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015；2.華狐生物科技（中國）有限公司，遼寧 沈陽 110000）

紫蘇（Perilla frutescensLinn.）是我國衛(wèi)生部首批公布的60 種藥食兼用型植物之一，分布于我國長江中下游[1]，為唇形科一年生草本植物[2]。我國是紫蘇資源大國，紫蘇類別極為豐富[3]，其被作為藥物或調味香料應用歷史悠久。

目前國內外對紫蘇的研究多集中在其所含的化學成分和活性物質方面，已在紫蘇屬植物中發(fā)現(xiàn)黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類等化學成分，以及多種具有抗過敏、抗菌、抗炎、免疫調節(jié)等功能的活性物質[4]。紫蘇莖葉中的蛋白質量分數(shù)約為27%，紫蘇籽內蛋白質量分數(shù)更是高達39%（干質量）[5]，且氨基酸種類齊全，含有人體所需8 種必需氨基酸，是一種優(yōu)質的植物蛋白資源。目前對于紫蘇蛋白或紫蘇肽的研究已有一些報道，多集中在對紫蘇蛋白提取工藝的改進、紫蘇多肽的分離純化以及紫蘇肽的抗氧化功能等方面，對于紫蘇肽的其他生物功能活性或體內實驗少有研究。

我國是世界上老齡化問題最突出的國家之一。對男性而言，隨著年齡的增長，下丘腦-垂體-睪丸軸功能逐步減退，促性腺激素釋放激素分泌下降，睪丸供血減少，睪丸間質細胞數(shù)量減少，類固醇合成酶活性降低，血清睪酮水平下降，造成性欲和勃起功能減弱以及肌力下降等癥狀。同時，機體衰老產生過多的自由基，通過一系列過氧化鏈式反應引起睪丸間質細胞睪酮合成能力下降。疾病、肥胖、藥物和不良生活方式等因素可加速上述癥狀的產生[6]。精氨酸可以合成信號分子NO以及參與某些多胺類物質的合成，而NO和多胺對于男性勃起功能和精子生成至關重要，有研究顯示，補充精氨酸或富含精氨酸的蛋白質可以提高男性的性功能。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由紫蘇籽粕提取的紫蘇籽蛋白中富含精氨酸及其他多種功能性氨基酸，推測紫蘇籽蛋白可能具有改善男性性功能的作用。由于小分子肽比蛋白質和游離氨酸具有更高的生物利用度，更容易被機體吸收和發(fā)揮生理活性，本實驗通過酶解法進一步將紫蘇籽蛋白酶解為分子質量更小的紫蘇籽肽，比較紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對男性性功能的影響。環(huán)磷酰胺具有生殖毒性，可造成睪丸組織學改變，引起氧化應激和脂質過氧化以及DNA損傷，還可以引起促性腺激素分泌紊亂和血清睪酮水平降低，進而造成性功能障礙。本實驗以自制紫蘇籽肽為研究對象，通過對大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，構建大鼠生殖損傷模型，并連續(xù)灌胃不同劑量的紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白，通過檢測大鼠血清中免疫和生殖相關的細胞因子、蛋白和激素水平，以及相關基因表達量變化等，分析紫蘇籽肽對大鼠生殖損傷狀況的改善作用，以期為開發(fā)紫蘇籽肽新的生物活性和新的植物源活性肽提供思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡SPF級SD雄性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；生產許可證號：SCXK（京）2016-0006；使用許可證號：SYXK（京）2017-0033；體質量（2 6 0±2 0）g。實驗動物飼養(yǎng)在無菌環(huán)境，溫度（20±2）℃，晝夜照明時間12 h∶12 h。實驗期間動物自由進食和飲水。

紫蘇籽粕由華狐生物科技（中國）有限公司提供；紫蘇籽蛋白與紫蘇籽肽為北京市蛋白功能肽工程技術研究中心實驗室制備。

大鼠睪酮酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠游離睪酮ELISA試劑盒南京森貝伽生物科技有限公司；Rodent卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA試劑盒、Rodent促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA試劑盒美國Endocrinetech公司；環(huán)磷酰胺江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；L-精氨酸、西地那非北京索萊寶科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）ELISA試劑盒、鼠白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）ELISA試劑盒、鼠干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）ELISA試劑盒碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

Spectra MR多功能酶標儀美國Dynex公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國賽默飛世爾科技有限公司；A300氨基酸自動分析儀德國曼默博爾公司；UDK-159全自動凱氏定氮儀意大利Velp公司；LC-20AD型高效液相色譜儀日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽制備

紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽的制備參考文獻[7-8]并略作修改。

紫蘇籽蛋白：紫蘇籽粕經堿溶萃取（pH 10），離心（3 000 r/min、20 min）、酸沉（pH 4.4）、熱處理、擠壓過濾、中和回調、均質，最后滅菌、噴霧干燥，制得紫蘇籽蛋白粉。

紫蘇籽肽：將紫蘇籽蛋白粉以1∶10（m/V）比例混合勻漿，并調節(jié)pH值至5.5～6.0，制得蛋白勻漿；加熱蛋白勻漿至45～55 ℃，并向其中同時加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶，保溫攪拌4 h后，滅酶，制得紫蘇籽肽酶解液；對紫蘇籽肽酶解液離心，收集上清液并調節(jié)pH值至6.0～6.5，得到紫蘇籽肽離心液；用陶瓷膜過濾紫蘇籽肽離心液，收集過濾液，得到一級過濾液；用納濾膜過濾一級過濾液，收集截留液，得到二級過濾液；紫蘇籽肽二級過濾液減壓濃縮，再將濃縮液用硅藻土過濾，滅菌、噴霧干燥后得到紫蘇籽肽。

1.3.2 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽基本理化性質分析

獲得的紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽，依據GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，用全自動凱氏定氮儀測定樣品中蛋白質量分數(shù)；依據GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》測定樣品中酸溶蛋白質量分數(shù)，并用高效液相色譜測定樣品分子質量；依據GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，利用氨基酸自動分析儀測定樣品中氨基酸組成及質量分數(shù)。

1.3.3 大鼠造模及分組

實驗動物經適應性喂養(yǎng)1 周后，稱體質量，隨機分為空白組、模型組、西地那非組、精氨酸組以及低、高劑量紫蘇籽肽組和低、高劑量紫蘇籽蛋白組。除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/（kgmb·d），連續(xù)5 d[9]，建立生殖損傷大鼠模型；空白組大鼠每天注射等體積生理鹽水。造模結束后，西地那非組大鼠灌胃西地那非5 mg/（kgmb·d），精氨酸組大鼠灌胃精氨酸0.3 g/（kgmb·d），低、高劑量紫蘇籽肽組大鼠分別灌胃紫蘇籽肽0.3、0.6 g/（kgmb·d），低、高劑量紫蘇籽蛋白組大鼠分別灌胃紫蘇籽蛋白0.3、0.6 g/（kgmb·d），空白組和模型組大鼠每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)6 周。

1.3.4 大鼠血清生化指標檢測

末次灌胃后，禁食12 h，稱體質量，對大鼠眼眶取血，血液在4 ℃放置過夜后，于4 ℃、3 500 r/min條件下離心20 min，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f明書步驟操作，用ELISA法檢測大鼠血清睪酮、游離睪酮濃度及LH、FSH、IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度[10-11]。

大鼠脫頸處死后，取形態(tài)病理學觀察實驗剩余睪丸和腎臟組織，經液氮速凍后于-80 ℃保存，用于大鼠睪丸和腎臟組織MDA含量、SOD活力測定。

1.3.5 大鼠臟器指數(shù)測定

眼眶采血后，大鼠脫頸處死，收集胸腺、脾臟、睪丸和腎臟組織，稱質量，按下式計算臟器指數(shù)[12]。

1.3.6 睪丸和腎臟組織形態(tài)病理學觀察

大鼠脫頸處死后，分別切取合適大小的睪丸和腎臟組織，經4 g/100 mL多聚甲醛溶液固定，用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察大鼠睪丸和腎臟組織形態(tài)變化。

1.3.7 實時熒光定量PCR檢測大鼠睪丸組織P450scc、3β-HSD、StAR和SF-1mRNA相對表達量

大鼠脫頸處死后，取形態(tài)病理學觀察實驗剩余睪丸組織，經液氮速凍后于-80 ℃保存，用于實時熒光定量PCR檢測。用試劑盒提取組織中總RNA，PCR條件為：95 ℃孵育10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH為內參，計算大鼠睪丸中睪酮合成相關的細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶（P450 cholesterol side-chain lyase，P450scc）、3 β-羥基類固醇脫氫酶（3 β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）、類固醇急性反應蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）和類固醇生成因子1（steroidogenic factor-1，SF-1）mRNA相對表達量。所用引物序列如表1所示。

表 1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據處理與分析

采用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據，結果以平均值±標準差表示；采用組間t-檢驗進行顯著性差異分析，P＜0.05表示具有顯著性差異；采用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽的基本理化性質分析結果

表 2 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽的氨基酸組成Table 2 Amino acid compositions of Perilla seed protein and peptide prepared in this study

表 3 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽的蛋白含量與分子質量分布Table 3 Protein contents and molecular mass distribution of Perilla seed protein and peptide

由表2、3可知，紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白中富含天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等人體必需氨基酸或功能性氨基酸；紫蘇籽肽與紫蘇籽蛋白中蛋白質量分數(shù)相當，但紫蘇籽肽中酸溶蛋白質量分數(shù)明顯較高，mw＜1 000 Da組分所占比例相比于紫蘇籽蛋白明顯提高。

2.2 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠體質量的影響

由圖1可知，紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周期間，各組大鼠體質量增加無顯著差異；灌胃結束時，精氨酸組大鼠體質量增長量較其余各組明顯較高，但并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖 1 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃處理期間性功能損傷大鼠體質量變化Fig. 1 Changes in body mass of rats with impaired sexual function during intragastric administration of Perilla seed protein and peptide

2.3 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度的影響

IL-2和INF-γ是機體重要的免疫調節(jié)因子，IgG是血清中主要的免疫球蛋白，通過ELISA法檢測大鼠血清中上述指標可以評價大鼠的免疫功能。由圖2可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度均顯著降低（P＜0.05），分別為空白組的28.07%、66.22%和92.38%；與模型組相比，西地那非和精氨酸組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度出現(xiàn)不同程度的升高；與模型組相比，除紫蘇籽肽低劑量組大鼠血清IFN-γ質量濃度外，其余各處理組大鼠上述指標也均出現(xiàn)不同程度升高。紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，紫蘇籽肽高劑量組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度分別是模型組的1.56、1.15、1.23 倍；紫蘇籽蛋白高劑量組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG水平分別是模型組的2.10、1.31、1.62 倍。由此可知，紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽能夠不同程度地提高環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度，從而調節(jié)大鼠機體免疫。這可能與紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽中富含蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸等可參與免疫球蛋白合成或可調節(jié)機體免疫的氨基酸有關。

圖 2 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠血清IL-2（A）、IFN-γ（B）、IgG質量濃度（C）的影響Fig. 2 Effects of Perilla seed protein and peptide on serum IL-2 (A),IFN-γ (B) and IgG concentrations (C) in rats with impaired sexual function

2.4 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠血清睪酮和游離睪酮濃度的影響

睪酮是雄性動物體內最重要的雄激素，游離睪酮被運送到目標細胞后與雄激素受體結合進而發(fā)揮雄激素作用。由圖3可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠血清睪酮和游離睪酮濃度均顯著下降（P＜0.05），分別是空白組的81.52%和63.99%；與模型組相比，西地那非和精氨酸組大鼠血清睪酮和游離睪酮濃度均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，除紫蘇籽蛋白高劑量組外，其余各處理組大鼠血清睪酮和游離睪酮濃度也均顯著升高（P＜0.05）。紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，紫蘇籽肽高劑量組睪酮和游離睪酮濃度分別是模型組的1.21 倍和2.01 倍（P＜0.05），表明紫蘇籽肽可顯著提高環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠血清中雄激素水平。這可能與紫蘇籽肽中豐富的酪氨酸、絲氨酸、谷氨酸和精氨酸以及支鏈氨基酸的促睪酮分泌活性有關[13-14]。

圖 3 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠血清睪酮（A）和游離睪酮濃度（B）的影響Fig. 3 Effects of Perilla seed protein and peptide on serum testosterone (A)and free testosterone concentration (B) in rats with impaired sexual function

2.5 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠血清LH和FSH質量濃度的影響

LH和FSH可以促進睪酮的合成和精子產生，對二者聯(lián)合檢測可以判斷睪丸功能。由圖4可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠血清LH和FSH質量濃度顯著下降（P＜0.05），分別是空白組的28.54%和86.49%；與模型組相比，西地那非和精氨酸組大鼠血清LH質量濃度出現(xiàn)不同程度的升高，F(xiàn)SH質量濃度沒有顯著變化（P＞0.05）。紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，與模型組相比，紫蘇籽肽低、高劑量組大鼠血清LH和FSH質量濃度均顯著升高（P＜0.05），紫蘇籽肽高劑量組大鼠血清LH和FSH質量濃度分別是模型組的3.93 倍和1.16 倍；與模型組相比，紫蘇籽蛋白低、高劑量組大鼠僅血清LH質量濃度顯著升高（P＜0.05），且提升效果弱于高劑量紫蘇籽肽，血清FSH質量濃度沒有顯著變化（P＞0.05），這可能與支鏈氨基酸維持和提高中樞神經興奮，促進激素分泌有關[14]。

圖 4 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠LH（A）和FSH（B）質量濃度的影響Fig. 4 Effects of Perilla seed protein and peptide on serum LH (A) and FSH (B) concentration in rats with impaired sexual function

2.6 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠腎臟和睪丸SOD活力和MDA含量的影響

圖 5 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠腎臟和睪丸SOD活力的影響Fig. 5 Effects of Perilla seed protein and peptide on SOD activity in kidney and testis of rats with sexual function impairment

SOD活力和MDA含量是機體重要的抗氧化指標，可以反映機體的抗氧化能力和氧化損傷程度。由圖5可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠腎臟和睪丸中SOD活力均顯著降低（P＜0.05），分別是空白組的94.55%和75.25%；與模型組相比，精氨酸組大鼠腎臟和睪丸SOD活力均顯著提高（P＜0.05），但西地那非組大鼠SOD活力并無顯著變化（P＞0.05）。紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，與模型組相比，各處理組大鼠腎臟和睪丸SOD活力均出現(xiàn)不同程度提高，其中紫蘇籽肽高劑量組大鼠腎臟和睪丸的SOD活力分別是模型組的2.65 倍和1.20 倍，紫蘇籽蛋白高劑量組大鼠腎臟和睪丸SOD活力分別是模型組的2.03 倍和1.19 倍，表明高劑量的紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽均可顯著提高環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠腎臟和睪丸的SOD活力（P＜0.05），增強大鼠機體抗氧化能力，這可能與精氨酸對SOD活性的激活作用有關[15]。

圖 6 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠腎臟和睪丸MDA含量的影響Fig. 6 Effects of Perilla seed protein and peptide on MDA contents in kidney and testis of rats with sexual function impairment

由圖6可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠腎臟和睪丸中MDA含量均顯著增加（P＜0.05），分別是空白組的1.17 倍和1.52 倍；與模型組相比，精氨酸組大鼠腎臟和睪丸中MDA含量均顯著降低（P＜0.05），而西地那非組大鼠睪丸中MDA含量相比于模型組顯著降低，但腎臟中MDA含量卻顯著升高（P＜0.05）。紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，與模型組相比，各處理組大鼠腎臟和睪丸中MDA含量均顯著降低（P＜0.05），其中紫蘇籽肽高劑量組大鼠腎臟和睪丸MDA含量分別是模型組的0.74 倍和0.58 倍，紫蘇籽蛋白高劑量組大鼠腎臟和睪丸MDA含量分別是模型組的0.80 倍和0.69 倍，表明紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽均可顯著降低環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠腎臟和睪丸中MDA含量，減輕脂質過氧化程度，這可能與紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽中半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸等參與自由基清除反應，以及谷氨酸、精氨酸等極性氨基酸通過側鏈螯合作用抑制自由基氧化反應有關[16]。

2.7 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠睪丸組織P450scc、3β-HSD、StAR和SF-1 mRNA表達量的影響

圖 7 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠睪丸組織P450scc和3β-HSD mRNA相對表達量的影響Fig. 7 Effects of Perilla seed protein and peptide on relative expression of P450scc and 3β-HSD mRNA in testis tissue of rats with impaired sexual function

由圖7可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠睪丸中P450scc和3β-HSDmRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05），分別是空白組的50.17%和34.88%；與模型組相比，西地那非和精氨酸組大鼠睪丸中P450scc和3β-HSDmRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，與模型組相比，各處理組大鼠睪丸中P450scc和3β-HSDmRNA相對表達量也均顯著升高（P＜0.05），其中紫蘇籽肽高劑量組大鼠睪丸中P450scc和3β-HSDmRNA相對表達量分別是模型組的3.30 倍和6.71 倍，紫蘇籽蛋白雖然也能夠提高這2 種基因的表達水平，但作用效果弱于紫蘇籽肽，說明紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽均可通過提高睪酮生成過程中關鍵酶的mRNA表達水平，從而促進睪酮合成。

圖 8 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠睪丸組織StAR和SF-1 mRNA相對表達量的影響Fig. 8 Effects of Perilla seed protein and peptide on relative expression of StAR and SF-1 mRNA in testis tissue of rats with impaired sexual function

由圖8可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠睪丸中StAR和SF-1mRNA相對表達量均顯著降低（P＜0.05），分別是空白組的66.06%和17.17%；與模型組相比，西地那非和精氨酸組大鼠睪丸中StARmRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05），但SF-1mRNA相對表達量無顯著變化；紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，與模型組相比，各處理組大鼠StARmRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05），其中紫蘇籽肽高劑量組大鼠睪丸中StAR和SF-1mRNA相對表達量分別是模型組的3.74 倍和5.50 倍。紫蘇籽蛋白雖然也能夠提高這2 種基因的表達水平，但作用效果弱于紫蘇籽肽。

2.8 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽對性功能損傷大鼠臟器指數(shù)的影響

表 4 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽處理對性功能損傷大鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 Effects of Perilla seed protein and peptide on organ indexes in rats with impaired sexual function

由表4可知，灌胃結束時，與空白組相比，模型組大鼠的脾臟、胸腺和睪丸指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），分別為空白組的67.47%、56.96%和77.95%，腎臟指數(shù)無顯著變化；與模型組相比，西地那非組大鼠僅睪丸指數(shù)顯著提高，而精氨酸組大鼠除睪丸指數(shù)外，胸腺指數(shù)也顯著提高（P＜0.05）；紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽灌胃6 周后，與模型組相比，紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白均可顯著提高大鼠免疫器官（脾臟和胸腺）指數(shù)（P＜0.05），且高劑量灌胃下的作用效果較為顯著，其中紫蘇籽肽高劑量組大鼠脾臟和胸腺指數(shù)分別是空白組的91.00%和84.81%；紫蘇籽蛋白高劑量組大鼠脾臟和胸腺指數(shù)分別是空白組的95.16%和88.61%，表明紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽均可通過提高免疫器官指數(shù)調節(jié)機體免疫。此外，各處理組大鼠腎臟指數(shù)與模型組相比均沒有顯著變化。高、低劑量的紫蘇籽肽均可以顯著提升性功能損傷大鼠睪丸指數(shù)，分別達到空白組的95.51%和96.77%，紫蘇籽蛋白的提高效果略弱于紫蘇籽肽，表明紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽均可通過提高睪丸指數(shù)調節(jié)環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠的睪丸功能。

2.9 HE染色觀察大鼠腎臟和睪丸形態(tài)學變化

圖 9 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽處理大鼠睪丸HE染色圖像Fig. 9 HE stained image of testis tissue of rats treated with Perilla seedprotein and peptide

由圖9可知，空白組大鼠生精小管基膜完整，生精上皮較厚，生精細胞層次和數(shù)量豐富，大量生精細胞和支持細胞排列緊密有序，形態(tài)規(guī)則正常，管腔形狀規(guī)則，管腔中可見大量精細胞；模型組大鼠生精小管的生精上皮變薄，生精細胞數(shù)量銳減，支持細胞排列稀疏，部分生精細胞脫落至管腔中，管腔中形成明顯空腔，精細胞和成熟精子數(shù)量明顯減少；紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白低、高劑量組大鼠生精小管損傷情況明顯得到改善，生精細胞大量增加，排列緊密整齊有序，空腔明顯減小。

圖 10 紫蘇籽蛋白和紫蘇籽肽處理大鼠腎臟HE染色圖像Fig. 10 HE stained image of kidney tissue of rats treated with Perilla seed protein and peptide

由圖10可知，空白組大鼠腎小囊腔明顯，血管球形態(tài)正常，基膜完整，球旁細胞和致密斑明顯，腎小管形態(tài)正常；模型組大鼠腎小體腫脹增大變形，球內細胞增加，腎小囊腔變小，毛細血管間隙增大；紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白低、高劑量組大鼠腎小體腫大變形得到一定程度的改善，但仍與空白組有差異。

3 討 論

食物蛋白在酶解過程中可以產生一些小肽，除作為營養(yǎng)因子外，還具有調節(jié)機體生理功能的作用。肽的吸收速率快、耗能低、不易飽和，且不同肽之間的運轉無競爭性與抑制性[17]。肽的結構特性如鏈長、氨基酸組成等決定了其功能活性[18]。此外，肽還具有較好的酸、熱穩(wěn)定性、水溶性等優(yōu)點，適宜作為功能因子應用于不同食品[19]。

本實驗制備的紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白富含某些功能性氨基酸。例如，天冬氨酸可以參與核苷酸代謝，促進細胞周期進程[20]；蘇氨酸是免疫球蛋白中最豐富的必需氨基酸[21]；谷氨酸可用于合成參與免疫反應的蛋白以及作為核苷酸合成的能量底物；甘氨酸可以減輕炎癥反應，調節(jié)機體免疫[22]；亮氨酸及其代謝產物可通過提高血清中IgG和IgM水平，降低可溶性分化簇4和分化簇8含量，增強機體特異性免疫；精氨酸通過精氨酸酶途徑和NO合成途徑參與免疫調控以及精子生成[23-24]；脯氨酸通過其代謝產物5-吡咯啉羧酸調控細胞增殖和DNA合成，并影響促進精子生成的多胺類物質的合成。紫蘇籽肽的分子質量遠小于其蛋白，蛋白中的活性序列在酶解過程中得到充分釋放，更有利于機體吸收和發(fā)揮作用。

由于環(huán)磷酰胺在產生生殖毒性的同時還可以造成免疫抑制，本實驗檢測了大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG質量濃度。IL-2是調節(jié)機體免疫功能最主要的淋巴因子之一。INF-γ是活化T淋巴細胞產生的一種細胞因子，對免疫系統(tǒng)具有重要的調節(jié)作用[25]。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白[26]。ELISA法檢測結果顯示，紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白均能顯著改善環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠血清IL-2、INF-γ、IgG質量濃度以及脾臟和胸腺指數(shù)的降低，說明紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白可能具有增強免疫的作用。

睪丸受到多種細胞因子的調控，具有精子生成和睪酮合成兩大功能[27]。睪丸間質細胞經一系列活動合成睪酮[28]，睪酮合成以膽固醇為原料，StAR可以加速膽固醇從線粒體膜外轉運到膜內[29-30]，隨后在P450scc和3β-HSD等酶的催化下轉變?yōu)椴G酮[31]。SF-1可控制類固醇基因的特定轉錄[32]。紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白均可改善環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠睪丸中睪酮合成相關基因StAR、P450scc、3β-HSD和SF-1表達水平下降的狀況，且紫蘇籽肽的作用效果更加明顯。睪酮負責維持男性的精子生成和第二性征，血清睪酮水平不足可造成肌肉質量下降、體質量增加、勃起功能障礙、疲勞程度加劇和性欲低下等癥狀[33]。紫蘇籽肽可顯著提高性功能損傷大鼠血清中雄激素水平，且紫蘇籽肽的作用效果較紫蘇籽蛋白明顯。睪丸中LH與其受體結合[34]，作用于睪丸間質細胞，刺激睪酮合成；FSH作用于支持細胞，促進精子形成[35]。FSH和LH是睪丸功能必不可少的調節(jié)因子[36]。紫蘇籽肽可顯著提高大鼠血清LH和FSH濃度，改善大鼠睪丸功能低下的狀況。

機體中過量的活性氧自由基可導致細胞損傷及線粒體功能障礙，還可與精子膜脂質中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，損傷精子膜，引起精子核DNA損傷，使精子活力下降甚至功能喪失[37]；還可以破壞類固醇生成途徑的組成部分[38]，造成肌肉力量下降和性欲下降。SOD是細胞清除超氧陰離子自由基的特異性酶，MDA是脂質過氧化反應的最終產物，MDA含量可以間接反映細胞和機體的脂質過氧化程度[39]。紫蘇籽肽可顯著提高大鼠睪丸和腎臟中SOD活力，降低MDA含量，紫蘇籽蛋白作用效果略低于紫蘇籽肽。HE染色結果顯示，紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白還可以改善大鼠睪丸和腎臟組織的病理狀況，進而維持其正常生理功能。

綜上所述，干預期間紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白對大鼠體質量沒有顯著影響，可以改善環(huán)磷酰胺致性功能損傷大鼠睪丸和腎臟的病理狀態(tài)，提高臟器指數(shù)，顯著改善腎臟、睪丸的氧化應激狀態(tài)和睪丸功能。紫蘇籽肽可以提高大鼠睪丸中睪酮生成相關基因mRNA表達水平，提高血清中雄激素水平，表明紫蘇籽肽可以改善大鼠生殖損傷狀況，從而達到改善大鼠性功能損傷的作用。紫蘇籽蛋白的作用效果普遍低于紫蘇籽肽，這與紫蘇籽肽的分子質量小、易于被機體吸收以及活性序列得到充分釋放有關。另外，紫蘇籽肽和紫蘇籽蛋白還顯示出一定的免疫改善作用，提示其可能具有增強免疫的作用，需要進一步驗證和討論。