槲皮素通過Nrf2通路對糖尿病大鼠胰腺氧化損傷的拮抗作用機制

李 陽，蘇艷瑜，李國豪，李 琪，王宇翔，丁玉松

（石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌缺陷和胰島素作用障礙引起的一類慢性疾病[1-3]。在我國，DM患病人數(shù)持續(xù)增加[4-6]。有研究顯示，2019年全球DM患者已達到1.16億，預測2030年會增加到1.40億，未來將會對社會帶來巨大的經(jīng)濟壓力和負擔[7-8]。

已有大量研究表明，氧化損傷在DM中起到重要作用，氧化應激除直接對胰島細胞造成損傷外，還影響胰島素分泌[9-11]。因此，抗氧化治療可能是防治DM的重要途經(jīng)。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）作為目前發(fā)現(xiàn)的重要抗氧化應激轉(zhuǎn)錄因子，在應激狀態(tài)下啟動下游抗氧化酶體系，在DM發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。伏旭等[13]研究顯示，通過過表達Nrf2，誘導其下游抗氧化酶的表達，能夠減輕大鼠胰腺氧化損傷，從而對胰腺產(chǎn)生一定的保護作用。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，不僅可通過清除自由基表現(xiàn)出直接的抗氧化作用[14]，還可以激活肝臟中的Nrf2信號通路表現(xiàn)出間接的抗氧化作用[15]。目前，槲皮素是否能通過激活胰腺組織中Nrf2通路以拮抗DM大鼠胰腺氧化損傷尚未明確。

本研究旨在探討槲皮素拮抗DM大鼠胰腺氧化損傷的作用機制，通過建立2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，檢測由DM引起的胰腺氧化損傷，以及槲皮素干預后Nrf2信號通路及其下游關(guān)鍵抗氧化酶蛋白和mRNA的表達，以期為DM對胰腺組織的氧化損傷提供實驗依據(jù)，并為槲皮素拮抗DM所致胰腺組織氧化損傷提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD大鼠（動物使用許可證號：SYXK（新）2018-005；生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-005），體質(zhì)量（210±10）g，由新疆醫(yī)科大學提供。

槲皮素上海化學試劑有限公司；鏈脲佐菌素美國Sigma公司；A006-2谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、A001-3超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、A045-3蛋白標準測定試劑盒、A015總抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）檢測試劑盒和A003-1丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒南京建成生物科技有限公司；NADP(H):醌氧化還原酶1（NADP(H):quinone oxido-reductase-1，NQO1）小鼠單克隆抗體（A180）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）小鼠單克隆抗體、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）pi山羊多克隆抗體、兔多克隆抗體（ab137550）艾博抗（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

Accu-Check血糖檢測儀羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；電子天平德國賽多利斯儀器有限公司；FA2004B電子精密天平上海精密科學儀器有限公司；SHA-B恒溫水浴箱上海躍進醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機上海安亭化學儀器有限公司；Mu1iskan MK3酶標儀美國Bio-Rad公司；漩渦振蕩儀上海亞榮分析儀器有限公司；手動玻璃勻漿器生工生物工程（上海）股份有限公司；EDC-810實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃溶液的配制

低劑量槲皮素混懸液：參考楊冉等[16]的方法，稱取1 g槲皮素溶于50 mL去離子水中，配制質(zhì)量濃度20 mg/mL的槲皮素混懸液；高劑量槲皮素混懸液：稱取1 g槲皮素并溶于25 mL去離子水中，配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL的槲皮素混懸液。

1.3.2 動物模型的建立

48 只SD大鼠，體質(zhì)量（210±10）g，隨機選取10 只大鼠作為空白對照組，將剩余38 只大鼠進行T2DM造模。造模具體方法為每天飼喂高脂高糖飼料，飼喂2 周后腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kgmb，每周1 次，共2 次。以大鼠隨機血糖濃度不低于16.7 mmol/L作為造模成功的判斷標準。剔除造模失敗的8 只大鼠，將血糖水平達標的30 只大鼠按血糖濃度分層隨機分為T2DM模型組、低劑量槲皮素（L-QU）干預組、高劑量槲皮素（H-QU）干預組，每組10 只。正常對照組、T2DM模型組大鼠均灌胃去離子水，L-QU、H-QU干預組大鼠分別以100、200 mg/kgmb的劑量灌胃相應槲皮素混懸液，每天1 次，干預12 周。實驗期間大鼠自由飲水、攝食，每周定期測定大鼠體質(zhì)量、血糖水平，觀察并記錄大鼠活動情況、飲水量、攝食量、尿液量。

1.3.3 血液標本采集和胰腺組織提取

大鼠麻醉后眼球取血，立即離心（3 600 r/min、10 min），收集血清。頸椎脫臼處死大鼠，即刻取出胰腺組織，用預冷生理鹽水沖洗血漬，待濾紙吸干后，用精準電子天平稱質(zhì)量。眼科剪分取0.4 g胰腺組織，置于玻璃勻漿管口剪碎，加入9 g/100 mL生理鹽水，充分研磨至無纖維狀物質(zhì)，制成10 g/100 mL的胰腺組織勻漿，4 ℃、3 600 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃保存，使用前室溫下解凍。

1.3.4 血清胰島素水平測定

采用放射免疫法[17]檢測大鼠血清胰島素水平。胰島素抵抗（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）指數(shù)按下式計算。

1.3.5 胰腺組織氧化和抗氧化指標測定

按照試劑盒說明書步驟，分別采用硫代巴比妥酸法測定大鼠胰腺組織MDA含量，微量酶標法測定GSH濃度和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，WST-1法測定SOD活力，比色法測定T-AOC，考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.3.6 免疫印跡檢測胰腺抗氧化酶表達量

在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置于冰上。蛋白定量后加入上樣緩沖液并煮沸，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離樣品并轉(zhuǎn)膜。用TBST洗滌3 次后，用牛血清白蛋白封閉2 h，再用TBST洗滌3 次，加入二抗在室溫下孵育，用TBST洗滌3 次，用ECL試劑顯影，以GAPDH為內(nèi)參，通過光密度法測定Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白的相對表達量[18]。

1.3.7 實時定量PCR測定Nrf2信號通路抗氧化酶mRNA表達量

檢測Nrf2、GST、HO-1、NQO1mRNA表達量。TRIzol法提取胰腺組織中總RNA，將符合條件的RNA反轉(zhuǎn)錄成cRNA，反應條件：25 ℃、5 min，50 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、10 min。cDNA進行6 倍稀釋，反應體系：4 μL 6×cDNA、0.4 μL 10 μmol/L正向引物、0.4 μL 10 μmol/L反向引物、10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL 50×ROX Reference Dye 2、4.8 μL超純水。反應條件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)。根據(jù)基因序列設計特異性引物，以GAPDH為內(nèi)參，運用實時熒光定量PCR檢測，以2-ΔΔCt進行數(shù)據(jù)分析。引物序列如表1所示。

表 1 PCR擴增基因引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of genes

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用Graphpad Prism軟件繪圖。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗期間大鼠一般情況

正常對照組大鼠一般狀況良好，毛發(fā)光澤、活動迅速，攝食量、飲水量、尿液量均正常；T2DM模型組大鼠情況一般較差，精神萎靡、毛發(fā)無光澤、弓背蜷體、反應遲鈍，攝食量、飲水量、尿液量均增加。與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠的上述癥狀有所改善。

2.2 槲皮素干預后大鼠體質(zhì)量和血糖的動態(tài)變化趨勢

圖 1 槲皮素干預后T2DM大鼠體質(zhì)量的變化趨勢Fig. 1 Variation trend of body mass in T2DM rats with quercetin intervention

表 2 槲皮素干預對T2DM大鼠體質(zhì)量和血糖濃度的影響Table 2 Effect of quercetin on body mass and blood glucose levels in T2DM rats

由表2可知，各組大鼠初始體質(zhì)量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），經(jīng)槲皮素干預12 周后，與正常對照組相比，T2DM組大鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05）。結(jié)合實驗期間大鼠體質(zhì)量的變化趨勢（圖1）分析，正常對照組大鼠體質(zhì)量始終呈上升趨勢，T2DM組大鼠體質(zhì)量下降幅度最大，L-QU、H-QU干預組大鼠體質(zhì)量下降幅度較T2DM組小。

由表2可知，造模結(jié)束后與正常對照組相比，T2DM模型組大鼠血糖濃度顯著升高（P＜0.05）；L-QU、H-QU干預組大鼠血糖濃度與T2DM組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；槲皮素干預12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠血糖濃度均顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，槲皮素可以降低T2DM大鼠血糖濃度。

2.3 槲皮素干預后大鼠血清胰島素水平的變化

表 3 槲皮素干預對T2DM大鼠血清胰島素含量和HOMA-IR指數(shù)的影響Table 3 Effect of quercetin on serum insulin levels and HOMA-IR index in T2DM rats

由表3可知，槲皮素干預12 周后，與正常對照組相比，T2DM模型組大鼠的血清胰島素含量顯著降低（P＜0.05），HOMA-IR指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠HOMA-IR指數(shù)顯著下降（P＜0.05），表明槲皮素干預可以減輕T2DM大鼠的胰島素抵抗。

2.4 槲皮素干預后大鼠胰腺的氧化損傷變化

表 4 槲皮素干預對T2DM大鼠胰腺氧化損傷的影響Table 4 Effect of quercetin on oxidative pancreatic damage in T2DM rats

由表4可知，槲皮素干預12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠胰腺MDA含量均顯著降低（P＜0.05），SOD活力、T-AOC水平、GSH-Px活力和GSH濃度均顯著上升（P＜0.05）。結(jié)果表明，低、高劑量的槲皮素干預可以減輕T2DM大鼠胰腺組織氧化損傷，可能與SOD、T-AOC、GSH-Px以及GSH水平的提高有關(guān)，機體抗氧化能力的提高使T2DM大鼠的血糖水平有所改善，并減輕胰島素抵抗。

2.5 槲皮素干預后大鼠胰腺中Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白表達的變化

由圖2可知，槲皮素干預12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠胰腺Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白的相對表達量均顯著上升（P＜0.05），表明槲皮素干預可以提升T2DM大鼠胰腺Nrf2蛋白的表達，從而激活下游抗氧化酶，使HO-1、GST、NQO1蛋白的表達上調(diào)，從而使T2DM大鼠胰腺內(nèi)MDA含量顯著降低（P＜0.05），改善胰腺氧化損傷，降低血糖水平，并減輕胰島素抵抗。

圖 2 槲皮素干預對T2DM大鼠胰腺Nrf2、NQO1、HO-1、GST蛋白表達的影響Fig. 2 Effect of quercetin on Nrf2, NQO1, HO-1 and GST protein expression in T2DM rats

2.6 槲皮素干預后大鼠胰腺中Nrf2、NQO1、GST、HO-1 mRNA表達的變化

圖 3 槲皮素干預對T2DM大鼠胰腺Nrf2、NQO1、GST、HO-1 mRNA相對表達量的影響Fig. 3 Effect of quercetin on mRNA expression levels of Nrf2, NQO1,GST and HO-1 in T2DM rats

由圖3可知，槲皮素干預12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠胰腺Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA相對表達量均顯著升高（P＜0.05），L-QU干預組大鼠胰腺GSTmRNA相對表達量與T2DM模型組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），僅H-QU干預組大鼠的胰腺GSTmRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05）。表明槲皮素干預可能通過激活Nrf2通路，上調(diào)Nrf2mRNA表達水平，進而上調(diào)下游相關(guān)抗氧化酶表達，使T2DM大鼠胰腺內(nèi)MDA含量顯著下降，減輕胰腺氧化損傷。

3 討 論

DM已經(jīng)成為危害我國城鄉(xiāng)居民健康的重大公共衛(wèi)生問題，DM及其并發(fā)癥的防治主要是通過降糖藥物和胰島素控制血糖，但血糖控制效果況并不理想[19-21]。長期使用降糖藥物會有明顯的副作用，植物化學物具有獲取方便、廉價、副作用小等特點，受到研究者的青睞[22]。

多項研究表明槲皮素對DM患者具有一定的保護作用[23-25]。本研究結(jié)果表明，槲皮素干預12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠的血糖濃度、HOMA-IR指數(shù)顯著降低（P＜0.05），這一結(jié)果與Wang Zhenzhi等[26]的研究結(jié)果一致。這說明槲皮素具有降血糖作用，可以減輕T2DM大鼠的胰島素抵抗。

氧化應激在DM發(fā)病過程中具有非常關(guān)鍵的作用。隨著人們對氧化應激認識的不斷深入，通過抗氧化途徑尋找預防和治療DM及其并發(fā)癥的方法，使抗氧化治療有望成為一種新的DM及其并發(fā)癥的防治手段[27]。研究表明，氧化應激參與DM發(fā)生、發(fā)展的整個過程，減輕氧化損傷可能會阻止或延緩DM發(fā)展及其并發(fā)癥的發(fā)生。DM患者由于胰島β細胞受損，其體內(nèi)抗氧化酶含量及活性相對降低，高糖聚集形成的活性氧簇也會直接損傷胰島β細胞[28]。王建禮等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與T2DM模型大鼠相比，槲皮素干預使T2DM大鼠血清MDA濃度降低，SOD活力明顯上升，減輕了氧化損傷，從而發(fā)揮對胰腺的保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預組大鼠胰腺的MDA含量顯著降低，SOD活力、T-AOC水平、GSH濃度、GSH-Px活力均顯著上升，說明槲皮素干預可以減輕T2DM大鼠胰腺氧化損傷并能提高胰腺抗氧化能力。

有研究表明，Nrf2與抗氧化反應元件（anti-oxidative response element，ARE）結(jié)合，啟動下游II相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體/分子伴侶等基因轉(zhuǎn)錄和表達以抵抗氧化應激[30]。Nrf2/ARE信號通路是機體抵抗外界氧化的防御性轉(zhuǎn)導通路，能夠提高機體的抗氧化能力[31]。Nrf2通路作為重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路，與DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展之間有著密切聯(lián)系，并有望成為極具前景的DM干預新靶標[32]。

江穎娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過激活Nrf2信號通路上調(diào)HO-1、GST、NQO1蛋白及其mRNA表達水平，進而對肝臟氧化損傷產(chǎn)生一定的保護作用。Wu Yuanseng等[33]研究結(jié)果顯示，Nrf2信號通路被激活后，可拮抗高糖所致氧化應激誘導的胰島β細胞損傷。伏旭等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蛙皮素聯(lián)合脂多糖能夠誘導急性胰腺炎大鼠通過Nrf2蛋白的過表達，顯著上調(diào)胰腺中HO-1、NQO1蛋白及其mRNA表達水平，從而拮抗胰腺氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，與T2DM模型組大鼠相比，L-QU、H-QU干預組大鼠胰腺Nrf2蛋白及其mRNA表達水平均顯著上升，下游抗氧化酶HO-1、NQO1的蛋白及其mRNA表達量均顯著上升，表明槲皮素可通過激活Nrf2通路，上調(diào)下游相關(guān)抗氧化酶表達，拮抗DM所致胰腺氧化損傷。

槲皮素作為防治DM的天然植物化學物質(zhì)一直備受關(guān)注。多項研究結(jié)果表明，槲皮素具有調(diào)節(jié)血糖的作用[23-24]，但機制尚不明確。本研究結(jié)果表明，槲皮素可能是通過激活胰腺組織Nrf2信號通路，調(diào)節(jié)下游抗氧化酶表達，進而減輕胰腺氧化損傷，改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血糖水平，從而發(fā)揮防治DM的作用。