鐵嶺市疾病預(yù)防控制中心 （ 遼寧 鐵嶺 112000）

內(nèi)容提要： 目的：分析蠟樣芽胞桿菌采用VITEK-2全自動微生物鑒定儀檢測的結(jié)果。方法：使用標(biāo)準(zhǔn)方法對蠟樣芽胞桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株、陽性菌株檢測，使用VITEK-2全自動微生物鑒定系統(tǒng)檢測，對比兩種檢測方法的檢出時間和檢出率。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)方法與VITEK-2全自動微生物鑒定儀在19株蠟樣芽胞桿菌檢測中符合率為100.00%，縮短檢測時間為7～47h。結(jié)論：VITEK-2全自動微生物鑒定系統(tǒng)在鑒定蠟樣芽胞桿菌中具有較高的準(zhǔn)確性，且檢測速度更為快捷，操作步驟更為簡便等特點(diǎn)，對于食源性疾病監(jiān)測、食物中毒檢測工作中更適合。

在芽胞桿菌中包括蠟樣芽孢桿菌，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道，菌體細(xì)胞呈現(xiàn)桿狀，末端方，成短鏈（至少1.0～3.0μm）或長鏈（1.2～3.0μm），適宜生長溫度在20～45°C，若生長溫度在10°C以下則會減慢生長速度或者停止生長?，F(xiàn)階段關(guān)于蠟樣芽孢桿菌細(xì)菌的報道中，多以食源性疾病為主，在食物中檢出此細(xì)菌的概率較大。若人體過多攝入蠟樣芽孢桿菌細(xì)菌，會增大食物中毒癥狀的發(fā)生概率。所以，進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌細(xì)菌的快速、精準(zhǔn)檢測，對于保障人們健康有著至關(guān)重要的影響。蠟樣芽孢桿菌細(xì)菌分布范圍較廣，是菌體細(xì)胞中典型的一種，某些菌株可生出1.5μm有色桿狀腸毒素，其孢子為橢圓形，會出現(xiàn)腹瀉型胃腸炎腸毒素和致嘔吐型胃腸炎腸毒素兩類，因此，對于該細(xì)菌的檢查對臨床具有重要的意義。對于VITEK-2檢測儀的應(yīng)用，能在避免人為誤差發(fā)生的同時，通過對反應(yīng)結(jié)果自動讀取、生成，實(shí)現(xiàn)對食源性疾病的高效檢測。且相較于傳統(tǒng)API生化鑒定的應(yīng)用，VITEK-2檢測儀的準(zhǔn)確性更高。目前對于蠟樣芽孢桿菌的檢查通常采用檢驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)的方法，VITEK-2全自動微生物鑒定系統(tǒng)檢測是今年發(fā)展起來的檢查方法，而本次研究為了改善蠟樣芽胞桿菌的檢測結(jié)果，利用并分析VITEK-2全自動微生物鑒定系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)方法檢測蠟樣芽胞桿菌陽性菌株及蠟樣芽胞桿菌的結(jié)果，內(nèi)容如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來源

本單位工作中分離、疾控中心、中國藥品生物制品鑒定所、中國普通微生物菌種保藏中心分別提供10株、5株、2株、2株蠟樣芽胞桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基和檢測儀器

VITEK-2全自動微生物鑒定儀、濁度儀（型號XA22-STZ-A1）、BAC芽孢桿菌鑒定卡（型號REF V1304：20張卡片/盒）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)GB/T4789.14-2003蠟樣芽胞桿菌的方法檢測，選取GB/T4789.28-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑，使用GB//T4789.2食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定。

1.2.2 VITEK-2全自動微生物鑒定儀檢測。復(fù)蘇1 9株蠟樣芽胞桿菌陽性菌株和蘇云金芽孢桿菌1菌株，在甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基上接種，溫度32°C，時間13h，選取典型菌落，劃線并分離，置于血瓊脂平板和含有多黏素菌B的瓊脂平板上，溫度、時間分別為32°C、13h，實(shí)施溶血和純培養(yǎng)試驗(yàn)。分離純培養(yǎng)的菌株，同氯化鈉0.9%溶液+菌苔充分混勻，調(diào)菌懸液至0.3～0.5麥?zhǔn)隙?，置于鑒定卡架上，連接菌液管和BAC鑒定卡，輸入鑒定卡信息至VITEK-2全自動微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定卡置入儀器充填室實(shí)施自動填充，完成后將鑒定卡取出置入孵育室實(shí)施自動培養(yǎng)和檢測，15～18h后得到結(jié)果。

2.結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果

蠟樣芽胞桿菌19株在營養(yǎng)瓊脂平板（包含多粘菌素B）菌落形態(tài)是融蠟狀、邊緣不整、不透明、灰白色。

2.2 蠟樣芽胞桿菌采取標(biāo)準(zhǔn)方法檢測

2.2.1 證實(shí)試驗(yàn)。革蘭陽性桿菌，芽胞全部在菌體內(nèi)。明膠液化、動力、硝酸鹽還原、厭氧下葡萄糖發(fā)酵、過氧化氫酶、甘露醇分別為（+）、（+）、（+）、（+）、（+）、（-）。

2.2.2 鑒別蘇云金芽孢桿菌試驗(yàn)。紅色結(jié)晶小體和游離芽胞均不存在，結(jié)果是陰性。

2.3 VITEK-2全自動微生物鑒定儀系統(tǒng)檢測蠟樣芽胞桿菌

19株菌株的鑒定結(jié)果：調(diào)兵山8#菌株、7#菌株98%蠟樣芽胞桿菌；調(diào)兵山10#菌株、11#菌株、9#菌株、6#菌株、5#菌株、1#菌株，開原2#菌株、3#菌株、4#菌株96%蠟樣芽胞桿菌；調(diào)兵山2#菌株、3#菌株、4#菌株，開原1#菌株91%蠟樣芽胞桿菌。標(biāo)準(zhǔn)1#菌株、標(biāo)準(zhǔn)2#菌株分別為100%蠟樣芽胞桿菌、100%蘇云金芽孢桿菌。鑒定時間為15h。

3.討論

蠟樣芽胞桿菌攝入量直接影響到患者食物中毒的發(fā)生概率，以＞105CFU/g（mL）為標(biāo)準(zhǔn)值，若人體蠟樣芽胞桿菌攝入量超過上述閾值，極易引起食物中毒現(xiàn)象的發(fā)生。具體癥狀表現(xiàn)為類似于金黃色葡萄球菌的嘔吐型和以及類似于氣莢膜梭菌的腹瀉、腹痛型，不同癥狀的潛伏期不同。

標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌的方法中，病原菌鑒定利用生化性狀觀察形態(tài)、培養(yǎng)特性等證實(shí)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，在具體工作中，因?yàn)閺?fù)雜的檢測樣本和蠟樣芽胞桿菌導(dǎo)致的中度癥狀是非特異性，鑒定病原菌工作具有很大難度，常常需要利用較多項(xiàng)技術(shù)實(shí)施綜合驗(yàn)證和判斷[1]。同時在標(biāo)準(zhǔn)方法中，鑒別蘇云金芽孢桿菌也比較繁瑣同時鑒定時間大大延長，是由于此類均同蠟樣芽胞桿菌生化特性、培養(yǎng)形態(tài)相似度較高[2]。

VITEK在檢測蠟樣芽胞桿菌是利用VITEK-2鑒定系統(tǒng)生化鑒定純培養(yǎng)的菌落[3]。生化反應(yīng)項(xiàng)目超過30項(xiàng)，較標(biāo)準(zhǔn)方法生化反應(yīng)項(xiàng)目多很多[4]。本研究結(jié)果可知，19株蠟樣芽胞桿菌、陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株VITEK可信度分別為96%、100%，根據(jù)有動力特征性反應(yīng)、強(qiáng)溶血、典型的純培養(yǎng)菌落特征，可對VITEK的鑒定結(jié)果進(jìn)行證實(shí)。同時完成鑒別蘇云金芽孢桿菌。所以利用VITEK鑒定蠟樣芽胞桿菌使實(shí)驗(yàn)步驟減少，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到不良因素影響而出現(xiàn)的誤差概率，縮短檢測時間，較標(biāo)準(zhǔn)方法檢測節(jié)省7～47h[5]。

VITEK特點(diǎn)為重復(fù)性、操作簡單、敏感性、特異性、認(rèn)為誤差小，同時可自動分析、定期掃描、聯(lián)機(jī)孵育[6]。本研究利用VITEK快速鑒別蠟樣芽胞桿菌，驗(yàn)證了標(biāo)準(zhǔn)方法和形態(tài)學(xué)，說明其準(zhǔn)確性和可靠性[7]。所以，給予VITEK鑒定可快速鑒別食品中的蠟樣芽胞桿菌。

利用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定食物中毒病原菌需要時間較長，工作量大，盡管有時會將可疑菌株分離出來，但是因?yàn)闂l件不具備、經(jīng)驗(yàn)不豐富等原因?qū)τ谡_的判斷很難實(shí)現(xiàn)[8]。對VITEK充分利用，按照蠟樣芽胞桿菌的生化特性和培養(yǎng)可短時間內(nèi)鑒定，并減少人工，在檢測較多樣本時保證有序和冷靜的檢驗(yàn)。保證檢測報告及時且準(zhǔn)確，將科學(xué)依據(jù)提供給食源性疾病的處理工作中，應(yīng)用價值較高。