基于生物信息學篩選、分析和驗證骨肉瘤差異基因*

郭良煜，余鈴，陳敬騰，龔長天，施玉博，郭衛(wèi)春

430060 武漢，武漢大學人民醫(yī)院 骨科

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、轉(zhuǎn)移率高、侵襲力強等特點[1-2]。骨肉瘤最常見的部位是股骨遠端,且早期就會出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位最常見于肺部，其次是髂骨部位,并且是一個不良的預后指標[3]。早期對骨肉瘤的治療多以截肢為主，但預后較差,隨后引入化療從而改善了患者的預后[4]。至此，手術(shù)加化療成為骨肉瘤治療中常用的治療方法。但即使這樣，骨肉瘤患者的5年生存率仍不足20%[5]。因此，尋找新的治療方法提高骨肉瘤患者生存率的研究一直在進行。

近幾年,學者們開始運用生物信息學篩選與骨肉瘤有關(guān)的基因，如通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選出與骨肉瘤相關(guān)的基因GMFG[6]； 張晉煜[7]利用生物信息學發(fā)現(xiàn)NQO1、ALDH3A1基因的低表達提示骨肉瘤患者的預后不良；此外，Zhu等[8]篩選出了7個關(guān)鍵基因SLC18B1、RBMXL1、DOK3、HS3ST2、ATP6V0D1、CCAR1和C1QTNF1，都與骨肉瘤的能量代謝有關(guān)。雖然相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了一些骨肉瘤潛在的分子靶標,但與常見的腫瘤如肺癌、肝癌等相比，治療該病的分子靶標相對較少。因此，本文通過查找GEO數(shù)據(jù)庫中的骨肉瘤數(shù)據(jù)從而找出差異基因，并通過Gene Ontology(GO)富集分析、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析和蛋白互作(protein-protein interactions,PPI)網(wǎng)絡圖找出最具有意義的基因，為新的治療方案提供參考或線索。

1 材料和方法

1.1 基因芯片的檢索和選取

登錄GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，輸入檢索目標“osteosarcoma和bioinformatics”，找出已經(jīng)公布的骨肉瘤基因芯片數(shù)據(jù)集[9]。隨后進行骨肉瘤數(shù)據(jù)集的篩選工作，所納入的骨肉瘤數(shù)據(jù)集必須滿足2個條件，否則不予納入：1)包含骨肉瘤病變組織或細胞系和正常骨組織或細胞系；2)基因芯片是人類全基因組數(shù)據(jù)。篩選出數(shù)據(jù)集GSE36001和GSE12865。GSE36001平臺包含20個骨肉瘤細胞組和6個正常組(2個成骨細胞系和4個正常骨組織)；GSE12865包含12個骨肉瘤組織組和2個正常組(2個成骨細胞系)。

1.2 篩選差異基因

采用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)篩選差異基因[10]。將GSE36001和GSE12865中的骨肉瘤組和正常組數(shù)據(jù)導入GEO2R中，篩選條件為校正后P<0.05，隨后差異基因以火山圖展示。然后將差異基因?qū)腠f恩圖在線制作軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作韋恩圖。

1.3 差異基因功能注釋和通路分析

DAVID(http://david.ncifcrf.gov)是一個公開的數(shù)據(jù)庫，整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具，其中包括了GO和KEGG分析等重要功能[11]。將差異基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫中進行GO和KEGG分析，篩選條件為P<0.05。

1.4 構(gòu)建和分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

STRING數(shù)據(jù)庫(第10.5版，https://string-db.org/cgi/input.pl)是進行蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫[11]，將GO和KEGG分析后所得到的差異基因?qū)氲絊TRING 9.1數(shù)據(jù)庫中，置信度選擇“Medium 0.400”，隨后將STRING 9.1數(shù)據(jù)庫中得到的數(shù)據(jù)導入到Cytoscape(第3.6.1版,http://www.cytoscape.org/)中得到PPI網(wǎng)絡圖，隨后使用CytoHubba插件按照Degree算法選取PPI網(wǎng)絡圖中排名前5的基因[12]。

1.5 HCMDB數(shù)據(jù)庫驗證

HCMDB是一個用于存儲和分析腫瘤的數(shù)據(jù)庫。其中數(shù)據(jù)庫的來源主要來于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫，一共收集了124個以前發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集,包含了29種癌癥類型。將由CytoHubba得到的基因輸入HCMDB中進行驗證。

2 結(jié) 果

2.1 確定共同的差異基因

通過GEO2R在線分析GSE36001和GSE12865兩個數(shù)據(jù)集，篩選出421個共同的差異基因(圖1A)，其中有187個基因是上調(diào)基因，234個基因是下調(diào)基因(圖1B)

圖1 差異基因的火山圖和維恩圖

2.2 差異基因的功能注釋和分析

對所篩選出來的421個差異基因進行GO和KEGG分析，按照P值進行排序，排名前5的結(jié)果見表1、2。在生物進程方面,差異基因參與的前5個生物學過程為蛋白激酶活性的激活、肽基-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、蛋白激酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、共同伴侶SMAD蛋白磷酸化和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正向調(diào)節(jié)。分子功能方面,差異基因的前5個功能為蛋白結(jié)合、肝素結(jié)合、蛋白的同源二聚化活動、離子型谷氨酸受體結(jié)合和蛋白激酶結(jié)合。細胞成分方面，差異基因前5個存在部位為胞外的外泌體、突觸前膜、粘著斑、脂筏和突觸后密度。信號通路方面，差異基因參與了Rap1信號通路、百日咳病、腎素分泌、甘油磷脂的新陳代謝和磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)。

表1 差異基因的GO分析

表2 差異基因的KEGG分析

2.3 PPI網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

將差異基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫中得到PPI網(wǎng)絡圖(圖2)，隨后用CytoHubba軟件，根據(jù)Degree得出排名前5的基因(圖3)，依次為：SMAD2、CD44、CXCL12、UBE2D3和KEAP1，5個基因均在骨肉瘤中下調(diào)。

圖2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡圖(PPI)

圖3 PPI網(wǎng)絡圖中的前5個差異基因

2.4 數(shù)據(jù)庫驗證

將CytoHubba軟件得到的排名前5的基因輸入HCMDB數(shù)據(jù)庫中進行驗證，以P<0.05為篩選條件，圖4顯示CD44、CXCL12、UBE2D3和KEAP1的表達水平與GSE36001和GSE12865的分析結(jié)果一致，在骨肉瘤中的表達均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001、P<0.001、P<0.001和P=0.021)。

圖4 CD44，CXCL12，UBE2D3和KEAP1在數(shù)據(jù)庫中的表達

3 討 論

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤，當前的治療主要以手術(shù)切除加放化療為金標準，但治療效果往往不佳[13]。近年來,隨著生物信息學技術(shù)的高速發(fā)展,可以挖掘疾病發(fā)生進展中的關(guān)鍵基因,為探索疾病的發(fā)病機制和治療帶來好處。例如Zheng等[14]認為LHPP蛋白的過表達可以抑制宮頸癌的增殖和轉(zhuǎn)移；Tan等[15]確認了BZRAP1-AS1是前列腺癌的一個預后指標；Cao等[16]認為COL1A12的表達在胃癌患者中具有重要意義，可以作為胃癌患者的預后指標。因此，可以通過利用生物信息學的方法預測潛在的靶基因。

首先，本研究組選取GSE36001和GSE12865兩個數(shù)據(jù)集，采用GEO2R選出差異基因，GEO2R是GEO數(shù)據(jù)庫自帶的差異基因分析工具，它能夠比較兩個或者多個樣本之間的區(qū)別從而尋找出差異基因。本研究共篩選出421個基因，其中187個上調(diào)基因和234個下調(diào)基因。隨后用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異基因進行GO和KEGG分析，GO分析主要包括3個方面：細胞成分、分子功能和生物進程；KEGG是一個包含了基因組學、基因所參與的生物學途徑、疾病和化學物質(zhì)等基本信息的數(shù)據(jù)庫。 將421個差異基因進行分析后，在生物進程方面差異基因參與蛋白激酶活性的激活、肽基-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、蛋白激酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等過程。分子功能方面差異基因功能為蛋白結(jié)合、肝素結(jié)合、蛋白的同源二聚化活動等功能。細胞成分方面差異基因存在部位為胞外的外泌體、突觸前膜、粘著斑等部位。信號通路方面差異基因參與了Rap1信號通路、百日咳病及腎素分泌等通路。隨后將差異基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫中得到PPI圖，而Cytoscape軟件是一款可以將PPI可視化的軟件，可以對PPI進行后續(xù)的分析，再使用插件CytoHubba根據(jù)Degree(代表一個基因相鄰分子的數(shù)量)篩選出排名前5的基因SMAD2、CD44、CXCL12、KEAP1和UBE2D3。最后在HCMDB數(shù)據(jù)庫中對5個基因進行驗證，發(fā)現(xiàn)CD44、CXCL12、KEAP1和UBE2D3在骨肉瘤中的表達均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與GSE36001和GSE12865的分析結(jié)果相一致，其中的3個基因已有文獻報道與骨肉瘤有相關(guān)性。研究者發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細胞中過表達CD44，接種裸鼠后增加了骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的概率[17]；Shi等[18]對骨肉瘤轉(zhuǎn)移樣本和非轉(zhuǎn)移進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)CXCL12在兩組中的表達量有差異且具有統(tǒng)計學意義；研究人員發(fā)現(xiàn)KEPA1在骨肉瘤中是低表達，且其表達與骨肉瘤患者的預后相關(guān)，表現(xiàn)為低表達患者預后較差[19]。雖然還沒有UBE2D3與骨肉瘤相關(guān)的研究，但數(shù)據(jù)庫提示在骨肉瘤中的表達具有統(tǒng)計學意義，且文獻報道UBE2D3的過表達增加了食管癌細胞放療的敏感性[20]。

總之，本次研究通過GEO數(shù)據(jù)庫里的數(shù)據(jù)信息進行了挖掘和分析，分析結(jié)果提示CD44、CXCL12、UBE2D3和KEAP1可能與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在本次研究中，因GEO數(shù)據(jù)庫缺乏骨肉瘤患者的生存時間和生存狀態(tài)，無法準確預測這些基因與骨肉瘤預后的關(guān)系，因此未來還需要繼續(xù)在GEO 數(shù)據(jù)庫中去發(fā)掘和探索更多符合研究條件的樣本芯片表達譜數(shù)據(jù)并進行驗證。

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