淺談諾如病毒核酸檢測試劑評價

陳慧毅 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心 （北京 100081）

內(nèi)容提要：諾如病毒導致的兒童和成年人急性胃腸炎經(jīng)常出現(xiàn)聚集發(fā)病，已經(jīng)成為比較嚴重的公共衛(wèi)生事件。近幾年諾如病毒核酸檢測試劑申報企業(yè)數(shù)量也在逐年上升，為提高此類產(chǎn)品的質(zhì)量和方便監(jiān)管人員的審評尺度，文章介紹了諾如病毒核酸檢測試劑的性能要求和研發(fā)過程中可能需要關(guān)注的問題。

諾如病毒（Norovirus，NV）是導致兒童和成年人急性胃腸炎的主要病原體，臨床表現(xiàn)以起病急，傳播快，嘔吐等為主要特征[1]。諾如病毒感染在冬季呈季節(jié)性高發(fā)[2]。諾如病毒為單股正鏈無包膜的RNA病毒，屬于杯狀病毒科，包括3個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）。ORF1編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的復制過程；ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白（VP1）；ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白（VP2）[3]。諾如病毒分7個基因組（GⅠ-GⅦ）和40多個基因亞型，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，我國目前最常見的諾如病毒為GⅠ，GⅡ，其中諾如病毒GⅡ占到86.9%[3,4]。為提高此類產(chǎn)品的質(zhì)量和方便監(jiān)管人員的審評尺度，本文介紹了諾如病毒核酸檢測試劑的性能要求和研發(fā)過程中可能需要關(guān)注的問題。

1.預期用途

產(chǎn)品的預期用途決定了產(chǎn)品的定位，明確了產(chǎn)品未來的使用場景，不僅需要說明檢測指標的臨床意義，更加限定了使用人群。建議申請人在說明書的預期用途部分明確樣本類型和檢測的基因型別等信息。不同樣本類型和基因型別需要在分析性能研究中分別驗證。

2.企業(yè)參考品、質(zhì)控品和內(nèi)對照的設(shè)置

企業(yè)參考品是考察產(chǎn)品性能的重要工具。一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、精密度參考品等。陽性參考品是評價準確度的重要指標，設(shè)置需要覆蓋能夠檢出的基因型別，保證產(chǎn)品不漏檢。陰性參考品重點考察產(chǎn)品的特異性，一般需要設(shè)置常見的腸道病原體以及容易產(chǎn)生交叉反應的病原體。精密度參考品建議包括產(chǎn)品能夠檢出的基因型別和不同濃度梯度，其中包括檢測限附近的濃度。由于諾如病毒比較容易獲取，且人工構(gòu)建的質(zhì)粒和真實病毒差異較大，不能完全反映檢測試劑的性能，所以企業(yè)參考品不建議使用質(zhì)粒。

試劑盒的質(zhì)量控制體系一般包括陰陽質(zhì)控品、內(nèi)對照等。陰陽質(zhì)控品應參與樣本處理以及核酸的提取環(huán)節(jié)，等同于樣本參與操作的全過程。內(nèi)對照可對試驗過程可能存在的擴增反應抑制物、儀器、試劑和操作等所導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制（內(nèi)對照既要保證其熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶核酸序列檢測造成的抑制而導致假陰性）。只有設(shè)置全面的質(zhì)量控制體系才能保證檢測過程的完整，有利于檢測結(jié)果的分析。

3.分析性能

3.1 核酸提取效率的評價

核酸提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物等，這些都是決定PCR成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，申請人都應對核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細的驗證。需要申請人提交核酸提取效率的評價資料，并且在說明書中注明配套使用的核酸提取試劑或核酸提取儀型號，以方便使用者參考。

3.2 準確度評價

可以采用已上市同類產(chǎn)品的方法學比較、檢測陰陽性企業(yè)參考品等方法。其中陽性樣本或陽性企業(yè)參考品的檢測旨在評價試劑盒檢測范圍內(nèi)的各種主要型別是否能被檢出。陰性樣本或陰性企業(yè)參考品旨在評價試劑特異性。

3.3 包容性的評價

由于病毒容易出現(xiàn)變異，不同時間、區(qū)域的病毒可能在基因序列存在差異，申報產(chǎn)品能否檢測出不同時間、區(qū)域的病毒株是能否滿足臨床檢測要求的重要指標。包容性驗證中建議使用臨床樣本，樣本濃度建議使用最低檢測限濃度附近。

3.4 最低檢測限評價

最低檢測限能夠反映試劑的最低檢出能力，是評價試劑性能的重要指標。

3.4.1 最低檢測限的建立

建議采用對已知濃度的樣本進行系列稀釋后重復檢測的方法，確定申報試劑的最低檢測限。在上述重復檢測過程中，記錄不同稀釋度樣本檢出的結(jié)果。采用適當?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit模型）和分析方法，計算試劑在設(shè)定概率下的檢測限，一般選擇檢測濃度具有95%的陽性檢出率。

建議通過另外制備最低檢測限濃度水平的病毒稀釋液對95%的檢出率進行確認。

3.4.2 最低檢測限的驗證

申請人應在病毒最低檢測限或接近最低檢測限的濃度，對每種型別的病毒（病毒株或臨床樣本）進行驗證。

每種病毒型別分別建立和驗證最低檢測限。

3.5 精密度評價

精密度包括重復性、中間精密度和再現(xiàn)性，一般建議申請人對試劑精密度進行全面評價。申請人進行精密度評價應主要關(guān)注以下幾點。

首先，需要對影響精密度的主要變量進行驗證，包括操作者、時間、地點、測量儀器、測量程序、試劑批次、檢測輪次等，精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。

其次，設(shè)定合理的評價周期，一般建議進行為期20d檢測。

再次，建議使用臨床樣本或病毒株進行精密度評價，并至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中或強陽性樣本。①陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率為100%（n≥20）。②臨界陽性樣本：待測物濃度略高于最低檢測限水平，陽性檢出率為100%（n≥20）。③中或強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

3.6 特異性

3.6.1 交叉反應

用于交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣微生物、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體、感染部位的定植菌等。如：輪狀病毒、腸道腺病毒、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌屬、志賀菌屬、臨床常見厭氧菌等。

建議選擇高濃度水平的交叉反應物進行驗證。通常，細菌感染的水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高。

申請人應提供所有病原體的詳細資料，包括病原體的來源、確認方法、濃度檢測方法等。

3.6.2 干擾物質(zhì)

建議申請人根據(jù)所采集的樣本類型，針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度進行評價，并在諾如病毒臨界陽性水平進行檢測。潛在干擾物質(zhì)的選取應至少包括：血紅蛋白、白細胞、黏蛋白、糞便中未消化的食物纖維、臨床常用藥物干擾等。

4.陽性判斷值

陽性判斷值確定資料主要指對申報產(chǎn)品核酸檢測的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進行確認的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應提供灰區(qū)的確認資料。建議申請人采用受試者工作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲線的方式確定申報試劑用于結(jié)果判斷的臨界值。有關(guān)ROC曲線分析的細節(jié)，請參考國內(nèi)外相關(guān)的文件。如采用其他方法對陽性判斷值進行確認研究，應說明這種方法的合理性，提供內(nèi)對照值的確定方法和研究資料。閾值設(shè)置應科學合理。

另外，建議通過臨床評價進一步驗證和確認陽性判斷值的準確性。

5.討論

諾如病毒通過以糞口途徑傳播為主，患者的嘔吐物、排泄物形成的氣溶膠，極易造成環(huán)境污染，導致聚集性病例，可能引起重癥和死亡，成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[5,6]。及時的尋找致病病原體和切斷傳播途徑，是防止疾病大面積擴散的有效手段。

本文簡單介紹了此類產(chǎn)品上市前的性能要求，包括設(shè)定合理的預期用途、制備完善的企業(yè)參考品、充分合理的分析性能驗證、正確的陽性判斷值等。產(chǎn)品的設(shè)計開發(fā)驗證是一個系統(tǒng)工程，前期還需要對原材料進行嚴謹?shù)暮Y選驗證，制定嚴格的質(zhì)量控制標準。同時還需要對產(chǎn)品涉及的各種生產(chǎn)工藝進行研究確認。上市前還需要研究產(chǎn)品的長期穩(wěn)定性，開封穩(wěn)定性，運輸穩(wěn)定性等。最后還需要提供臨床評價資料證明產(chǎn)品的臨床有效性。諾如病毒是一種RNA病毒，隨著時間容易發(fā)生變異和重組，重組型諾如病毒的RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）區(qū)和VP1區(qū)差異會導致不同基因亞型[7]。產(chǎn)品設(shè)計開發(fā)過程中需要重點關(guān)注設(shè)計的引物探針序列是否在保守區(qū)域，能否檢出突變株。同時，考慮到我國區(qū)域遼闊，建議申請人選擇不同時間、區(qū)域的樣本進行驗證，保證臨床檢測中不漏檢。