大鼠體內(nèi)外細(xì)胞色素P450酶活性檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

夏麗軍 陳偉東 劉進(jìn)

[摘要] 目的 建立快速、簡(jiǎn)便、靈敏可以同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)外“雞尾酒”探針?biāo)幬锖痛x產(chǎn)物的LC-MS/MS方法，并用于大鼠肝微粒體外代謝和大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。 方法 所有樣品均加入乙腈進(jìn)行沉淀處理，然后在UPLC CORTECS C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）色譜柱分離，質(zhì)譜方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。液相方法采用梯度洗脫流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水。 結(jié)果 6種探針?biāo)幒痛x產(chǎn)物的體內(nèi)外樣品方法學(xué)驗(yàn)證符合生物樣品檢測(cè)要求。該方法成功應(yīng)用于大鼠體內(nèi)外“雞尾酒”實(shí)驗(yàn)中。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)建立的“雞尾酒”方法可用于體內(nèi)外快速評(píng)價(jià)藥物或中草藥對(duì)相應(yīng)的CYP450亞型酶活性的影響，可以用于潛在的藥物相互作用的預(yù)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞色素P450;大鼠肝微粒體;探針?biāo)?UPLC-MS/MS

[Abstract] Objective To establish a rapid， simple and sensitive LC-MS/MS method for simultaneous determination of "cocktail" probe drugs and metabolites in vivo and in vitro of rats， and to apply it to studies of in vitro metabolism of rats′ liver microsomes and in vivo pharmacokinetics of rats. Methods Both in vivo and in vitro samples were treated by acetonitrile precipitation method. Probe drugs and metabolites were detected by UPLC CORTECS C18 （2.1 mm×50 mm， 1.6 μm） chromatographic column combined with UPLC-MS/MS method of multiple reaction monitoring mode（MRM）， in which acetonitrile-0.1% formic acid water was used as gradient elution method of mobile phase. Results Methodological verification of samples in vitro and in vivo of 6 probe drugs and metabolites met the requirements of biological sample detection. The method had been successfully applied to "cocktail" experiments in vivo and in vitro of rats. Conclusion The "cocktail" method established in this experiment could be used to rapidly evaluate the efficacies of drugs or Chinese herbal medicines on the activities of the corresponding CYP450 subtypes enzymes in vivo and in vitro and could be used to predict potential drug interactions.

[Key words] Cytochrome P450; Rat liver microsomes; Probe drugs; UPLC-MS/MS

細(xì)胞色素P450酶（Cytochrome P450 proteins，CYP）是體內(nèi)I相代謝的主要代謝酶超家族，大約能代謝超過(guò)90%的藥物和內(nèi)源性物質(zhì)[1-2]，其中，經(jīng)CYP1A2、CYP2B6、CYP2D6、CYP2C9，CYP2E1和CYP3A4代謝的藥物占所有經(jīng)CYP代謝藥物的80%以上[3-5]。藥物、食物和中草藥等可通過(guò)抑制或誘導(dǎo)藥物代謝酶來(lái)改變其他藥物的代謝和藥代動(dòng)力學(xué)特性，從而導(dǎo)致藥物之間相互作用。其中，對(duì)CYP酶的抑制作用會(huì)增加藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)或降低所需的治療效果。研究者通常使用體外P450酶抑制試驗(yàn)來(lái)研究經(jīng)P450代謝的藥物相互作用（Drug-drug interaction，DDI）或中草藥藥物相互作用（Herb-drug interaction，HDI）的可能機(jī)制。目前研究者已開(kāi)發(fā)了幾種混合使用P450探針底物的混合物進(jìn)行肝微粒體溫育的雞尾酒方法，可以高通量地檢測(cè)經(jīng)P450酶代謝藥物相互作用的預(yù)測(cè)，但是，目前大多數(shù)文獻(xiàn)都是單一的體內(nèi)或體外“雞尾酒”方法[6-9]，本實(shí)驗(yàn)將體內(nèi)和體外“雞尾酒”方法相結(jié)合，采用UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，為預(yù)測(cè)藥物相互作用提供較全面的數(shù)據(jù)，可以用于潛在的藥物相互作用的預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

非那西?。≒h，批號(hào)：ILTFG-PD）和安非他酮（Bu，批號(hào)：31677-93-7）購(gòu)于Tokyo Chemical Industry公司，右美沙芬（Dex，批號(hào)：D299445）、甲苯磺丁脲（Tol，批號(hào)：64-77-7）和氯唑沙宗（Chl，批號(hào)：95-25-0）購(gòu)于J&K Scientific，咪達(dá)唑侖（Mdz，批號(hào)：20180207）產(chǎn)自江蘇恩華藥業(yè)，羥基安非他酮（OH-Bu，批號(hào)：92264-81-8） 購(gòu)自加拿大TLC Pharmaceutical Standards Ltd.，羥基咪達(dá)唑侖（OH-Mdz，批號(hào)：59468-85-8）、右啡烷（Dep，批號(hào)：125-73-5）、羥基甲苯磺丁脲（OH-Tol，批號(hào)：5719-85-7）、羥基氯唑沙宗（OH-Chl，批號(hào)：475295-90-0）和對(duì)乙酰氨基酚（Ac，批號(hào)：103-90-2）購(gòu)于Toronto Research Chemicals公司;色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司。色譜級(jí)甲酸購(gòu)自阿拉丁生化試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。大鼠肝微粒由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器

ACQUITY I-Class 超高效液相串聯(lián)XEVO TQD三重四級(jí)桿質(zhì)譜和Masslynx 4.1軟件（美國(guó)Weters公司）;5430R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）;TE4101-L電子天平（北京賽多利斯儀器公司）;電熱恒溫振蕩水槽（上海森性實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液配制

精密稱取10 mg各探針?biāo)?，然后加?0 mL甲醇，配成1 mg/mL儲(chǔ)備液;精密稱取1 mg各代謝產(chǎn)物，然后加入10 mL甲醇，配成0.1 mg/mL儲(chǔ)備液并避光后于4℃保存。

1.4 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC CORTECS C18 column（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）;流動(dòng)相為A相乙腈，B相0.1%甲酸-水，梯度洗脫流程為：0.0～0.6 min，10%～50%A;0.6～1.0 min，50%～80%A;1～2 min，80%～95%A;2.0～2.5 min，95%A;2.5～2.6 min，95%～10%A;2.6～3.0 min，10%A。流速為0.4 mL/min，柱溫保持在40℃，樣品進(jìn)樣量為2 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源采用ESI源并采用多離子監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，同時(shí)采用正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式。其中毛細(xì)管電壓為2000 V，脫溶劑氣溫度和流量分別為500℃和1000 L/Hr，錐孔氣流量50 L/Hr，離子源溫度為150℃。各探針?biāo)幖捌浯x產(chǎn)物的離子對(duì)相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)信息見(jiàn)表1。

1.6 樣本處理

1.6.1 血漿樣本處理? 精密量取100 μL血漿樣品置于1.5 mL EP管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)地西泮（0.5 μg/mL）和200 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋1 min后在13 000 r/s離心5 min，取上清進(jìn)樣。

1.6.2 孵育樣品處理? 精密量取200 μL孵育液置于1.5 mL EP管中，加入200 μL冰乙腈和20 μL內(nèi)標(biāo)地西泮（0.5 μg/mL）沉淀蛋白，渦旋1 min后在13 000 rpm離心5 min，取上清進(jìn)樣。

1.7 方法學(xué)驗(yàn)證

按照FDA[10]和EMA[11]標(biāo)準(zhǔn)，取空白基質(zhì)、空白基質(zhì)+對(duì)照品和檢測(cè)樣品進(jìn)行專屬性考察;各探針?biāo)幖捌浯x產(chǎn)物取合適濃度的多個(gè)點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;各探針?biāo)幖捌浯x產(chǎn)物各取低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品（Quality control，QC），每個(gè)濃度5個(gè)樣品，連續(xù)分析3 d考察精密度和準(zhǔn)確度;取正常處理的QC，空白基質(zhì)預(yù)處理的QC和甲醇稀釋處理的QC考察回收率和基質(zhì)效應(yīng);QC樣本在室溫24 h、4℃、反復(fù)凍融3次和-80℃等不同保存條件下考察穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 分析方法專屬性

取空白基質(zhì)、空白基質(zhì)+對(duì)照品、大鼠口服探針?biāo)幒?.5 h的血漿和孵育后的孵育液按“1.6樣本處理”處理，見(jiàn)圖1。可知各探針?biāo)幖捌浯x產(chǎn)物峰型良好，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液并用甲醇稀釋，將Ph、Tol和Chl稀釋為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00和20.00 μg/mL;將Mdz、Dex和Bu稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 μg/mL;將OH-Chl、OH-Mdz和OH-Tol稀釋為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μM;將Dep、OH-Bu和AC稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μM;用空白基質(zhì)將上述梯度對(duì)照品稀釋10倍，按“1.6樣本處理”處理并進(jìn)樣，用Masslynx 4.1軟件導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表2。各標(biāo)曲線性良好，R2均>0.990。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

取空白基質(zhì)，按照“1.7方法學(xué)驗(yàn)證”項(xiàng)方法分別加入探針?biāo)幒痛x產(chǎn)物配成最小定量下限濃度（Lower limit of quantification，LLOQ） 和低、中、高3個(gè)濃度QC，Ph、Tol、Chl濃度為2、4、40、1600 ng/mL;Mdz、Bu、Dex濃度為1、3、30、150 ng/mL;OH-Chl、OH-Mdz、OH-Tol濃度為0.05、0.15、1.50、4.50 μM;Dep、OH-Bu、Ac濃度為0.01、0.03、0.30、0.90 μM;對(duì)同一濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，連續(xù)檢測(cè)3 d，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度，結(jié)果表明，LLOQ的精密度和準(zhǔn)確度均在20%以內(nèi)，3個(gè)QC的精密度和準(zhǔn)確度均在15%以內(nèi)，符合樣品分析要求。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取空白基質(zhì)，按照“1.7方法學(xué)驗(yàn)證”方法，制備LLOQ和3個(gè)不同濃度QC，同一濃度進(jìn)行5個(gè)樣品分析，得相應(yīng)的峰面積平均值A(chǔ)1;取空白基質(zhì)，按照“1.6樣本處理”方法處理，取上清，加入相應(yīng)濃度探針?biāo)幒痛x產(chǎn)物對(duì)照品，配成LLOQ和3個(gè)不同濃度QC，同一濃度進(jìn)行5個(gè)樣品分析，得相應(yīng)的峰面積平均值A(chǔ)2，提取回收率為A1/A2。用甲醇按照“1.7方法學(xué)驗(yàn)證”方法，制備LLOQ和3個(gè)不同濃度QC，同一濃度進(jìn)行5個(gè)樣品分析，得相應(yīng)的峰面積平均值A(chǔ)3，基質(zhì)效應(yīng)為A2/A3，結(jié)果表明，各探針?biāo)幖捌浯x產(chǎn)物QC的LLOQ提取回收率和3個(gè)不同濃度QC的提取回收率均>85%，基質(zhì)效應(yīng)均為85%～115%，符合分析要求。

2.5 穩(wěn)定性考察

取空白基質(zhì)按“1.7方法學(xué)驗(yàn)證”方法，制備LLOQ和3個(gè)不同濃度QC，考察樣品置于室溫24 h和4℃放置6 h，連續(xù)凍融3次，-80℃保存2周;每個(gè)濃度進(jìn)行平行5個(gè)樣品分析，結(jié)果RSD和RE結(jié)果均在±15%之間，化合物在上述不同條件下均穩(wěn)定，滿足分析要求。

2.6 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)應(yīng)用

Sprague-Dawley（SD）大鼠6只，動(dòng)物許可證號(hào)：wydw2019-650，體重為（220±20）g，禁食12 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，灌胃給予6種混合探針?biāo)幦芤?，其中Tol的劑量為1 mg/kg，其余為10 mg/kg。給藥后0.083、0.250、0.500、1、2、3、4、6、8、12和24 h分別通過(guò)大鼠尾靜脈采血0.3 mL并置于肝素化EP管中。接著將樣品于4000 rpm離心10 min后吸取上清至新的EP管中，并取100 μL血漿按“1.6樣本處理”項(xiàng)方法處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。各探針?biāo)幍乃巹?dòng)學(xué)參數(shù)和藥時(shí)曲線見(jiàn)表3、圖3。

2.7 體外混合探針?lè)跤龖?yīng)用

在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行以下的孵育條件的優(yōu)化：包含大鼠肝微粒體積的優(yōu)化（2～10 μL）;體外孵育緩沖液的優(yōu)化（0.1 M的磷酸鉀緩沖液，0.01 M的PBS 緩沖液和0.1 M Tris-HCl 緩沖液，pH均為7.4）;分別在10～100 min時(shí)間內(nèi)進(jìn)行孵育優(yōu)化。最終確定孵育體系總體積為200 μL，其中包含大鼠肝微粒體（蛋白質(zhì)濃度為0.4 mg/mL），磷酸鉀緩沖溶液（100 mM，pH=7.4），6種探針底物（Ph為40 μM，Bu和Chl為20 μM，Dex為10 μM，Tol為100 μM，Mdz為5 μM）。在37℃的水浴下預(yù)孵育5 min 后加入1 mM NADPH（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）啟動(dòng)反應(yīng)，孵育30 min。探針?biāo)嶱h、Bu、Tol、Dex、Chl、Mdz的反應(yīng)速率分別為0.0438、0.0037、0.0284、0.0414、0.0628、0.0682 pmol/（min·μg）。

3 討論

3.1 探針?biāo)幍倪x擇

在所有CYP亞型中，CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6含量較高，分別占CYP總量的40%、20%、13%、10%、2%和2%，并可以代謝大多數(shù)臨床處方藥[12-15]。其中CYP1A2參與多種臨床使用藥物的代謝，如氯氮平、他克林、替扎尼定、茶堿以及幾種重要的內(nèi)源性化合物[16-17]。CYP2B6代謝3%～8%的廣泛使用藥物，且據(jù)報(bào)道在乳腺腫瘤中也有高表達(dá)[18-19]。CYP2C9不僅有助于代謝10%～20%的常用處方藥，還有脂肪酸、前列腺素類和類固醇激素的代謝[13]。在肝臟和肝外器官中表達(dá)的CYP2D6介導(dǎo)大約25%的市售藥物代謝，如抗抑郁和抗精神病藥物[20]。同時(shí)，活動(dòng)減少的CYP2D6與高加索人群中的帕金森病有關(guān)[20]。CYP2E1作為天然乙醇誘導(dǎo)酶代謝活化各種致癌物質(zhì)，其活性增加與致癌過(guò)程有關(guān)[21]。此外，超過(guò)50%的藥物被CYP3A4代謝，包括抗生素、抗病毒藥物、苯二氮■類藥物、鈣通道阻滯劑、他汀類藥物和免疫抑制藥物[22-23]。

“雞尾酒”結(jié)合LC-MS/MS是現(xiàn)在使用最多、最廣的預(yù)測(cè)藥物相互作用的方法，每一種亞型酶均有多種探針?biāo)?，但是，許多探針?biāo)幉⒉皇墙?jīng)單一酶代謝，存在特異性不強(qiáng)的現(xiàn)象，根據(jù)FDA藥物相互作用的指南[24]，本實(shí)驗(yàn)選取專屬性較好的Ph（CYP1A2）、Bu（CYP2B6）、Tol（CYP2C9）、Dex（CYP2D6）、Chl（CYP2E1）和Mdz（CYP3A4）作為“雞尾酒”的探針?biāo)?，在大鼠體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均體現(xiàn)出較強(qiáng)的適宜性。

非那西汀的O-去乙基化是使用雞尾酒法進(jìn)行體外CYP1A2活性評(píng)估的最常用反應(yīng)，也是首選探針，非那西汀低于50 μM時(shí)，對(duì)其他探針?biāo)幋x基本無(wú)影響[25]，本實(shí)驗(yàn)中，非那西汀濃度為40 μM。安非他酮是CYP2B6的首選探針?biāo)帲诙喾N“雞尾酒”方法中均有應(yīng)用，安非他酮低于100 μM時(shí)對(duì)CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2E1活性無(wú)影響，高于50 μM時(shí)，對(duì)CYP 2C19、CYP2D6、CYP3A產(chǎn)生影響[26]，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)安非他酮的Km值，確定安非他酮的濃度為20 μM。雙氯酚酸和甲苯磺丁脲均可作為CYP2C9的探針?biāo)帲谄渌半u尾酒”方法出現(xiàn)的次數(shù)基本相似[27]，本實(shí)驗(yàn)選取甲苯磺丁脲作為CYP2C9的探針?biāo)?，濃度?00 μM。作為CYP2D6的探針?biāo)帲∵宦鍫柡陀颐郎撤沂褂幂^廣，但丁呋洛爾除主要經(jīng)CYP2D6代謝外，還經(jīng)CYP 1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19代謝，右美沙芬較丁呋洛爾專屬性更高，右美沙芬濃度低于25 μM時(shí)對(duì)其他探針?biāo)師o(wú)影響[28]，本實(shí)驗(yàn)中，右美沙芬濃度為10 μM。對(duì)于CYP2E1的探針?biāo)帲冗蛏匙趲缀跏俏ㄒ坏倪x擇，雖然苯胺是氯唑沙宗的推薦替代方法，但基本很少用于體外雞尾酒;氯唑沙宗濃度低于50 μM時(shí)對(duì)其他亞型酶基本無(wú)影響，本實(shí)驗(yàn)氯唑沙宗濃度為20 μM。CYP3A4作為肝微粒中含量最多的酶，較常見(jiàn)的探針?biāo)幱羞溥_(dá)唑侖、睪酮、硝苯地平，其中以咪達(dá)唑侖最為常用[29-30]，本實(shí)驗(yàn)亦選擇咪達(dá)唑侖作為CYP3A4探針?biāo)?，濃度? μM。

3.2方法優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS方法同時(shí)檢測(cè)6種探針?biāo)幒?種代謝產(chǎn)物，為了獲取較好的峰型、較短的檢測(cè)時(shí)間及較方便的處理方法，比較了UPLC BEH C18、UPLC CORTECS C18和UPLC HSS T3三種色譜柱，其參數(shù)分別為（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）和（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;乙酸乙酯液液萃取和乙腈沉淀法前處理;甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，最終選擇色譜柱UPLC CORTECS C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm），其可以使峰型良好。同時(shí)選擇響應(yīng)較高的乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，乙腈沉淀法處理樣品，完全能滿足本實(shí)驗(yàn)探針?biāo)幖捌浯x產(chǎn)物的檢測(cè)。

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（收稿日期：2020-03-25）