趙金玉，周 鵬，唐軍林，宋亞萍，劉慶國(guó)，武軍元*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

牛鼻支原體（Mycoplasma bovirhinis）屬于柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬，是導(dǎo)致牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合征和乳腺炎的病原之一[1]。1965 年，Harbourne 等[2]從英格蘭患有乳房炎的奶牛上首次分離到該病原。牛鼻支原體是一種致病性較弱的繼發(fā)性感染原，通?？膳c其他病原體混合感染，在機(jī)體抵抗力減弱的情況下，發(fā)揮致病作用引起繼發(fā)性感染使宿主病情加重[3]。牛鼻支原體的分離來(lái)源并不唯一，通常在患有肺炎犢牛的鼻拭子、肺臟組織中有較高的分離率，在健康犢牛的鼻腔中分離率則較低。從病牛的腎臟、奶樣、耳道中也有分離出牛鼻支原體的相關(guān)報(bào)道[4-7]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)牛鼻支原體的研究甚少，僅有對(duì)牛鼻支原體GS01 株全基因組序列分析的報(bào)道[8]。本研究使用支原體屬通用引物以及多種支原體特異引物對(duì)采集到的病牛鼻拭子和病死牛肺臟組織進(jìn)行檢測(cè)，并使用支原體培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，旨在確定臨床病例中支原體的感染分布，為牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中支原體相關(guān)疾病的防控提供資料，為相關(guān)支原體的深入研究提供參考菌株。

1 材料與方法

1.1 病料

采集新疆南疆某規(guī)?；膛?chǎng)發(fā)病犢牛鼻拭子30份，病死犢牛病變肺臟組織1份。發(fā)病犢牛出現(xiàn)咳嗽、氣喘、黏性鼻液等臨床癥狀；病死犢牛剖檢見(jiàn)：肺臟實(shí)變、大小不一的結(jié)節(jié)狀病灶。

1.2 試劑和儀器

支原體培養(yǎng)基PPLO Broth、PPLO Agar 均購(gòu)自BD 公司；馬血清購(gòu)自HyClone 公司；2×PCR Mix、基因組DNA提取試劑盒、pGM-simple-T fast 載體、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴(kuò)增反應(yīng)儀購(gòu)自BIO-RAD公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3 樣本處理

鼻拭子樣本：使用無(wú)菌鑷子將鼻拭子中的棉簽擠干。肺臟使用無(wú)菌外科剪從肺臟病健交界處剪開(kāi)一小口，從深部取黃豆樣大小組織塊于1.5 mL離心管中加1 mL生理鹽水充分研磨。

1.4 病原分離

將處理過(guò)的鼻拭子和肺組織研磨液1 500 r/min 離心3 min，取500 μL 上清液至含有酚紅指示劑的支原體液體培養(yǎng)基中，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃后，使用0.45 μm濾膜過(guò)濾傳入新的液體培養(yǎng)基，待液體培養(yǎng)基顏色變黃且澄清后，取200 μL培養(yǎng)液接入支原體固體培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，使用光學(xué)顯微鏡鏡檢，挑取“煎蛋狀”單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，經(jīng)3次純化后保菌。

1.5 PCR鑒定

支原體屬16S rRNA通用引物、牛支原體特異引物、牛鼻支原體特異引物、殊異支原體特異引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.5.1 DNA提取

取鼻拭子菌液、純培養(yǎng)液，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，取肺臟組織研磨沉淀，使用組織基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

使用表1 中的引物分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的目的基因片段。PCR 反應(yīng)體系25 μL：2×PCR mix12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL。支原體通用引物反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。牛支原體特異引物反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。牛鼻支原體特異引物反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。殊異支原體特異引物反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，53.6 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.5.3 克隆和測(cè)序

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR陽(yáng)性產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5.4 序列分析

登陸NCBI網(wǎng)站對(duì)測(cè)序完成的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并下載相似度較高的序列使用DNA star 軟件進(jìn)行同源性比較分析，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離純化結(jié)果（見(jiàn)圖1）

圖1 分離株菌落形態(tài)（40×）Fig.1 Colony morphology of isolates(40×)

由圖1可知，將處理過(guò)的病料接種于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48～72 h后，取顏色變黃的培養(yǎng)液使用0.45 μm濾膜傳代培養(yǎng)，直至液體培養(yǎng)基顏色變黃且不渾濁，然后取200 μL培養(yǎng)液接種至固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d 后在光學(xué)顯微鏡下鏡檢可觀察到“煎蛋狀”菌落。

2.2 分離株支原體屬引物PCR擴(kuò)增結(jié)果（見(jiàn)圖2、圖3）

由圖2、圖3 可知，提取分離純化后菌落基因組DNA，以支原體屬通用引物和牛鼻支原體特異引物分別擴(kuò)增出1 021 bp 和315 bp 的目的片段，與預(yù)期片段大小相符。以牛支原體、殊異支原體特異引物擴(kuò)增未能擴(kuò)增出任何條帶。

圖2 分離株支原體屬引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of Mycoplasma isolates with universal primers

2.3 序列分析

2.3.1 分離株同源性分析（見(jiàn)圖4）

將分離株的16S rRNA基因序列與GenBank已公布的7株支原體16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比。由圖4可知，分離株與牛鼻支原體甘肅株GS01（NZCP024049.1）的同源性為98.2%，與牛鼻支原體日本株HAZ141-2（NZAP018135.1）的同源性為97.9%；與牛支原體PG45 株（NZCP007589.1）、HB0801-P115 株（NC014760.1）的同源性分別為85.5%和85.8%；與犬支原體PG14 株（NR028813.1）、LV 株（NZCP011368.1）的同源性分別為94.9%和95.2%；與殊異支原體ATCC 27140株（NZCP007229.1）的同源性為80.6%。

2.3.2 分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（見(jiàn)圖5）

圖3 分離株牛鼻支原體特異引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of Mycoplasma bovirhinis isolates with specific primers

圖4 基于16S rRNA核苷酸序列的同源性比較Fig.4 Homology comparison based on 16S rRNA nucleotide sequence

圖5 基于支原體16S rRNA核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on Mycoplasma 16S rRNA nucleotide sequence

由圖5 可知，本研究分離株與牛鼻支原體GS01 株（NZCP024049.1）、牛鼻支原體HAZ141-2 株（NZAP018135.1）在同一分支，親緣關(guān)系最近，與犬支原體PG14株（NR028813.1）、LV株（NZCP011368.1）親緣關(guān)系較近，與牛支原體PG45 株（NZCP007589.1）、HB0801-P115株（NC014760.1）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與殊異支原體ATCC27140株（NZCP007229.1）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論

1981年，F(xiàn)riis[9]對(duì)牛鼻支原體的致病性進(jìn)行研究，嘗試通過(guò)人工感染牛鼻支原體導(dǎo)致?tīng)倥７窝?，但并未成功?017年，Hata等[10]首次公布牛鼻支原體日本株的全基因組序列。2018年，我國(guó)學(xué)者完成牛鼻支原體甘肅株的全基因組測(cè)序，并對(duì)其遺傳進(jìn)化關(guān)系和假定的毒力因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與牛支原體相比，牛鼻支原體甘肅株GS01缺少多個(gè)毒力基因，由此推測(cè)相關(guān)毒力基因的缺失造成其致病性低于牛支原體[8]。2020年，Catania等[11]對(duì)意大利新進(jìn)口的公牛進(jìn)行支原體感染情況的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)牛鼻支原體的感染率與季節(jié)有一定關(guān)系，夏季的感染率高于冬季，但環(huán)境因素的改變對(duì)牛支原體的感染率無(wú)顯著的影響。本研究中，犢牛發(fā)病集中在8月份，可能與季節(jié)轉(zhuǎn)換造成的應(yīng)激相關(guān)。

支原體屬的16S rRNA核苷酸序列具有較高的種間差異性和種內(nèi)保守性，可用于支原體的菌種鑒定[12]。對(duì)牛呼吸系統(tǒng)具有較強(qiáng)致病性作用的支原體有牛支原體、殊異支原體等。本研究對(duì)發(fā)病犢牛的鼻拭子和病死牛的肺臟組織進(jìn)行支原體檢測(cè)、分離，結(jié)果顯示病牛牛鼻支原體鼻拭子陽(yáng)性率為70%，并成功從病死牛肺臟組織中分離到1 株牛鼻支原體，未檢測(cè)分離到其他支原體。同源性分析顯示，分離株的16S rRNA 核苷酸序列與牛鼻支原體甘肅株GS01 和牛鼻支原體日本株HAZ141-2 的同源性分別為98.4%和98.2%。16S rRNA核苷酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示分離株與牛鼻支原體甘肅株GS01和牛鼻支原體日本株HAZ141-2的遺傳關(guān)系最近，從分子水平上證實(shí)該分離株為牛鼻支原體。本研究未對(duì)除支原體以外的其他病原進(jìn)行檢測(cè)，所以不能斷定該病原造成采樣牛場(chǎng)犢牛的發(fā)病及死亡。盡管牛鼻支原體的致病性與牛支原體相比較弱，但對(duì)該病原進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，病原分離仍有重要意義。

4 結(jié)論

本研從新疆南疆某規(guī)?；?chǎng)病死牛肺臟組織中分離到1株支原體，確定為牛鼻支原體，病牛鼻拭子牛鼻支原體檢測(cè)陽(yáng)性率為70%。本研究可為新疆地區(qū)牛場(chǎng)牛鼻支原體的感染情況提供參考。