何東寧, 周浩東, 劉暢, 譚琦, 谷澤慧, 王亞帝

(1.錦州醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 腫瘤內科，遼寧 錦州 121000； 2.錦州醫(yī)科大學 附屬第三醫(yī)院 精準醫(yī)學中心，遼寧 錦州 121000)

乳腺癌(breast cancer, BC)是世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤之一.現(xiàn)有的流行病學數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌的發(fā)病率正逐年增加.據(jù)統(tǒng)計，2018年全球新診斷的乳腺癌患者估計為268 670人，死亡人數(shù)估計為41 400人[1-2].乳腺癌的治療方法很多，且近年來手術、內分泌治療、抗HER-2(human epithelial growth factor receptor-2, HER-2)靶向治療方面均有較大進展，但整體預后仍不樂觀，原因在于目前對乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展尚未完全了解.因此，對乳腺癌分子機制的闡明、新預后標志物的尋找和潛在治療靶點的探索，仍是乳腺癌的研究方向和重點.

T細胞分化蛋白2(mal T-cell differentiation protein 2, MAL2)是MAL蛋白脂質家族的成員，是176個氨基酸殘基構成的4次跨膜蛋白.正常狀態(tài)下，MAL2主要參與胞吞并介導細胞間的物質轉運，作用于遞送膜結合蛋白的細胞內傳輸途徑，在細胞轉移中起重要作用[3-4].前期許多研究表明，MAL2在大腸癌[5]、胰腺癌[6]、卵巢癌[7]、肝癌[8]、乳腺癌[9-10]、腦膜瘤[11]、甲狀腺癌[12]及口腔鱗癌[13]中呈過表達，且與轉移及預后不良密切相關，但均未對MAL2基因作用機制及其與腫瘤病理特征的相關性進行深入研究.本研究通過生物信息學的方法，分析MAL2在乳腺癌中的表達及其與腫瘤病理特征和預后的關系，以期為乳腺癌的預后評估及發(fā)生發(fā)展機制的研究提供新的思路.

1 資料與方法

1.1 HPA數(shù)據(jù)庫檢索

HPA(The human protein atlas)是基于 RNA 測序分析和免疫組化分析的大型轉錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫[14](https: //www.proteinatlas.org/)，可用于正常組織和腫瘤組織蛋白的差異表達分析.方法為進入網站并在搜索框中輸入MAL2，點擊search；限定條件為①Gene：gene description、protein class；②RNA：RNA tissue category、RNA Tissue specificity score、RNA FPKM tissue specific；③Organ：breast and female reproductive system.

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(http://www.oncomine.org)進行不同腫瘤間的差異性表達分析.檢索條件設定為Gene：MAL2.對 Oncomine數(shù)據(jù)庫中所有與乳腺癌及MAL2基因相關的數(shù)據(jù)進行薈萃分析，觀察兩者的相關性.

1.3 Ualcan 數(shù)據(jù)庫檢索

Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/)數(shù)據(jù)庫[15]包含來自31種癌癥類型的 TCGA3 級 RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)，可提供對公開的癌癥組學數(shù)據(jù)的方便訪問，包括the Cancer Genome Atlas (TCGA)和MET 500隊列(從500個轉移瘤病人中獲得了轉移癌組織中基因組序列和免疫應答的詳細數(shù)據(jù))；允許識別生物標記物或對潛在的感興趣基因進行電子驗證；提供基于基因表達的描述基因表達和患者生存信息的圖表；評估乳腺癌和前列腺癌分子亞型中的基因表達，通過啟動子甲基化評估基因表達的表觀遺傳調控；通過連接HPRD、GeneCards、Pubmed、TargetScan、DRUGBANK、Open Targets和GTEx進行泛癌基因表達分析.方法為進入網站后選擇Analysis選項，使用Scan by genes檢索框，檢索條件為①Enter Gene symbol： MAL2；②TCGA dataset：Breast invasive carcinoma；③Explore.

1.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索

GEPIA 數(shù)據(jù)庫[16](http://gepia.cancer-pku.cn/)是由北京大學張澤民教授團隊開發(fā)的一種交互式網絡服務器，用于分析來自 TCGA 和GTEx項目的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的 RNA 測序表達數(shù)據(jù)，將TCGA 和GTEx數(shù)據(jù)進行整合，進行全面的表達分析.GEPIA提供網頁式交互展示和快速定制功能，包括腫瘤/正常差異表達譜分析、剖面繪制、根據(jù)腫瘤類型或病理分期進行分析、患者生存分析、相似基因檢測、相關性分析和降維分析等分析模塊.方法為進入網站后選擇single gene analysis，輸入MAL2，選擇survival analysis.限定條件為①Methods：overall survival；②Group cutoff：median；③Hazards Radio(HR)： Yes；④95% Confidence Interval：Yes；⑤Axis Units：Months；⑥Datasets Selection：BRCA.

1.5 STRING網絡分析

STRING version 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)是分析、預測蛋白質與蛋白質相互調控網絡的平臺，通過String數(shù)據(jù)庫預測MAL2蛋白的上下游調控蛋白及蛋白間的調控關系.檢索條件為①Protein Name：MAL2；②Organism：Homo sapiens；③選擇“More”；④點擊“Analysis”.

1.6 數(shù)據(jù)處理

參考林晏廷等[17]的數(shù)據(jù)處理方法，運用配對t檢驗進行配對樣本的組間比較，采用one-way ANOVA 分析MAL2mRNA 表達與乳腺癌臨床病理分期的關系，MAL2基因表達與預后的關系，采用Kaplan-Meier模型進行生存分析.所有數(shù)據(jù)采用在線統(tǒng)計學分析，P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 與乳腺癌預后相關的基因

運用 HPA 病理學圖集中的癌癥模塊進行分析，獲得如下信息：與乳腺癌預后相關的基因共有577個，其中與預后不良相關的基因有210個，與預后良好相關的基因有367個(圖1).表1列舉了與乳腺癌預后不良相關的前10位基因，其中與乳腺癌細胞轉移相關的MAL2基因列于此表，可用于后續(xù)分析.

圖1 HPA中與乳腺癌預后相關的基因表達情況Fig.1 Expression of genes associated with breast cancer prognosis in HPA表1 與乳腺癌預后不良相關的10個基因Table 1 10 genes associated with poor prognosis of breast cancer

基因簡稱基因全稱預測位置mRNA相對表達量P值TAGLN2轉運蛋白2細胞內318.42.06e-5ATP5F1BATP合酶F1亞基beta細胞內236.97.17e-6PTGES3前列腺素E合酶3細胞內102.02.15e-5MAL2Mal, T細胞分化蛋白(基因/假基因)細胞膜98.04.57e-6PGK1磷酸甘油酸激酶1細胞內86.57.05e-8DCTPP1dCTP焦磷酸酶1細胞內36.31.64e-5RAB5BRAS癌基因家族成員細胞內35.92.24e-5TPD52腫瘤蛋白D52細胞內35.61.11e-5PCMT1蛋白質L-異天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-甲基轉移酶細胞內,細胞膜30.94.02e-7TIMM17A線粒體內膜17A細胞膜23.61.98e-5

2.2 MAL2在BC組織和其他腫瘤組織中的表達

采用Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析MAL2在不同腫瘤類型中的差異性表達，檢索到MAL2基因相關的癌組織/正常組織差異表達分析結果共308個，其中，MAL2在癌組織中呈顯著高表達的有13個結果，呈低表達的有12個結果.其中10個分析結果均顯示MAL2基因在乳腺癌組織中呈高表達(圖2).

2.3 MAL2基因在BC組織中表達的薈萃分析

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中對描述BC的相關研究進行分析，共有10項符合條件的研究，分別對其進行對比分析發(fā)現(xiàn)，BC組織中MAL2表達均高于正常對照組織.為進一步明確BC和MAL2表達的相關性，對以上10項研究進行薈萃分析，結果發(fā)現(xiàn)，BC組織中MAL2表達水平明顯高于正常組織(P<0.05)(圖3).

2.4 MAL2 mRNA表達與BC臨床病理特征的關系

通過 Ualcan 分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫中MAL2在114例正常組織和1 097例BC組織中的差異表達情況.BC組織中MAL2表達高于正常乳腺組織(P<0.05，圖4A)，不同分期、性別及種族的BC之間MAL2表達無差別(圖4B、4C和4D)；不同BC分子分型MAL2表達均高于正常乳腺組織，其中Luminal型MAL2表達高于三陰性乳腺癌型(P<0.05，圖4E)；N2淋巴結轉移者MAL2表達高于N3組(P<0.05，圖4F)；不同激素水平的BC患者MAL2表達無差別(圖4G)；41～60歲患者組MAL2表達低于81～100歲患者組(P<0.05，圖4H)；從病理類型方面分析，浸潤性導管癌組MAL2表達高于浸潤性小葉癌、粘液癌及化

顏色深淺與MAL2基因差異表達排序有關，紅色塊代表MAL2基因在所有高表達的基因中位于前1%、前5%、前10%; 藍色塊代表MAL2基因在所有低表達的基因中位于前1%、前5%、前10%;白色塊代表MAL2基因在所有差異表達的基因中超出前10%.色塊上的數(shù)字：代表共有幾個研究支持此結果.泛癌:一項研究中包含3種以上的癌腫.離群值:基于腫瘤異質性進行的分析，只在腫瘤的某些亞型或特定群體中的異常表達.圖2 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中MAL2在不同腫瘤中差異性表達Fig.2 Differential expression of MAL2 in different tumors in Oncomine database

生癌組(P<0.05，圖4I)；在乳腺癌分子亞型中，三陰性乳腺癌的基底樣1型MAL2表達高于間充質干細胞型、間充質細胞型及不穩(wěn)定亞型組(P<0.05)，HER-2過表達型MAL2表達高于間充質干細胞型(P<0.05，圖4J).

圖3 Oncomine數(shù)據(jù)庫中MAL2在不同病理類型乳腺癌與正常組織中的差異性表達Fig.3 Differential expression of MAL2 in different pathological types of breast cancer and normal tissues in Oncomine database

(續(xù)上圖)

A：乳腺癌組織和正常組織中MAL2的差異性表達；1)與正常乳腺組織組比較，P<0.05；B：不同分期乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常乳腺組織組比較，P<0.05；C：不同性別乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)表示與正常人群組比較，P<0.05；D：不同種族乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常人群組比較，P<0.05;E：不同分子分型乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常乳腺組織組比較，P<0.05；2)與Luminal組比較，P<0.05；F：不同淋巴結轉移乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常乳腺組織組比較，P<0.05；2)與N2組比較，P<0.05；N0：無區(qū)域淋巴結轉移；N1：1～3個腋窩淋巴結轉移；N2：4～9個腋窩淋巴結轉移；N3：10個或更多腋窩淋巴結轉移；G：不同激素水平乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常激素水平組比較，P<0.05；H：不同年齡乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常人群組比較，P<0.05；2)與41～60歲組比較，P<0.05；I：不同病理類型乳腺癌中MAL2的差異性表達；1)與正常乳腺組織組比較，P<0.05；2)與浸潤性導管癌組比較，P<0.05；3)與浸潤性小葉癌組比較，P<0.05；4)與混合型癌組比較，P<0.05；5)與其他類型乳腺癌組比較，P<0.05；J：不同乳腺癌分子分型與TNBC亞型中MAL2的差異性表達.1)與正常乳腺組織組比較，P<0.05；2)與Luminal組比較，P<0.05；3)與HER-2過表達組比較，P<0.05；4)與基底樣型1組比較，P<0.05.A: Differential expression of MAL2 in breast cancer tissues and normal tissues;1) Compared with normal breast tissue, P<0.05;B: Differential expression of MAL2 in breast cancers of different stages; 1) Compared with normal group, P<0.05;C: Differential expression of MAL2 in breast cancers of different genders;1) Compared with normal group, P<0.05; D: Differential expression of MAL2 in breast cancer of different races; 1) Compared with normal group, P<0.05;E: Differential expression of MAL2 in breast cancer of different molecular types; 1) Compared with the normal group, P<0.05; 2) Compared with the Luminal group, P<0.05;F: Differential expression of MAL2 in breast cancer with different lymph node metastases; 1) Compared with the normal group, P<0.05; 2) Compared with N2 group, P<0.05; N0: no regional lymph node metastasis; N1: 1-3 axillary lymph node metastases; N2: 4-9 axillary lymph node metastases; N3: 10 or more axillary lymph node metastases;G: Differential expression of MAL2 in breast cancer with different hormone levels; 1) Compared with normal group, P<0.05;H: Differential expression of MAL2 in breast cancer of different ages; 1) Compared with normal group, P<0.05; 2) Compared with 41～60 years old group, P<0.05;I: Differential expression of MAL2 in breast cancer of different pathological types; 1) Compared with normal group, P<0.05; 2) Compared with invasive ductal carcinoma group, P<0.05; 3) Compared with invasive lobular carcinoma group, P<0.05; 4) Compared with mixed cancer group, P<0.05; 5) Compared with other types of breast cancer, P<0.05; J: Differential expression of MAL2 in different breast cancer molecular types and TNBC subtypes;1) Compared with normal group, P<0.05; 2) Compared with Luminal group, P<0.05; 3) Compared with HER-2 overexpression group, P<0.05; 4) Compared with basal-like type 1 group, P<0.05.圖4 Ualcan分析TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌MAL2 mRNA的表達Fig.4 MAL2 mRNA expression of breast cancer in TCGA database analysis by Ualcan

2.5 MAL2 mRNA的表達與BC預后的關系

進一步運用GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證TCGA 數(shù)據(jù)庫中BC組織MAL2的差異表達，發(fā)現(xiàn)BC中MAL2表達高于正常乳腺組織(P<0.05，圖5).運用GEPIA數(shù)據(jù)庫生存分析模塊分析MAL2的差異表達及MAL2與BC患者預后的關系，結果發(fā)現(xiàn)MAL2低表達及MAL2高表達者各535例.與MAL2高表達組相比，MAL2低表達組的總生存期延長(P=0.000 32，圖6)，MAL2差異表達對無疾病進展生存期無明顯影響(P=0.18，圖7).

1)與正常乳腺組織比較，P<0.05

2.6 MAL2與上下游蛋白的相互作用

在STRING網站中，分析MAL2與上下游蛋白的關系，可獲得相應的關系網絡圖(圖8).PPI富集P值(PPI enrichment p-value)為0.001 746，包含TPD52、TPD52L2、YIF1A、IGR、FRMD4B、SH3YL1、OCLN等與MAL2相互作用的節(jié)點數(shù)共有22個，其中TPD52、TPD52L2、OCLN與MAL2相互作用(score=0.93).MAL2主要參與補體和凝血級聯(lián)、細胞間緊密連接、白細胞經內皮細胞遷移等生物學過程(表2、3).

圖6 GEPIA 數(shù)據(jù)庫中不同MAL2 mRNA表達水平BC患者的總體生存率Fig.6 Overall survival rate of BC patients with different MAL2 mRNA expression in GEPIA database

圖7 GEPIA數(shù)據(jù)庫中不同MAL2 mRNA表達BC患者的無病生存率Fig.7 Disease free survival rate of BC patients with different MAL2 mRNA expression in GEPIA database

圖8 MAL2蛋白交互作用網絡圖Fig.8 MAL2 protein-protein interaction network map

表2 MAL2生物學過程Top5Table 2 Top5 of MAL2 biological process

表3 MAL2 KEGG信號通路Top5Table 3 Top5 of MAL2 KEGG signaling pathway

3 討論

目前多項研究已證實MAL2是一種四跨整合膜蛋白，位于染色體8q24，該位置的基因組不穩(wěn)定性增加，MAL2的表達上調可高達100倍[18]，這與多種人類癌癥的發(fā)生有關，包括腎癌、惡性間皮瘤、神經母細胞瘤、膽管癌等.同時，MAL2的高表達也與結直腸癌或胰腺癌患者的不良預后有關[5-6].雖然MAL2的高表達可能不是癌癥發(fā)生的驅動因素，但它可能通過改變蛋白質的靶向性導致蛋白質分布失調，從而促進腫瘤轉化，最終導致細胞形態(tài)、信號轉導和遷移能力的變化[19].因此，MAL2可能成為乳腺癌的生物學標志物和有效治療靶點，這對乳腺癌患者具有重要的臨床意義.

本研究通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫中的10項研究進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)MAL2mRNA在乳腺癌中呈顯著高表達.以 GEPIA和Ualcan軟件在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫中MAL2mRNA的差異性表達，結果與Oncomine 數(shù)據(jù)庫一致，即MAL2mRNA在乳腺癌中高表達.應用Ualcan分析不同臨床病理特征乳腺癌中的MAL2mRNA表達，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織MAL2mRNA的表達水平與患者年齡、分子分型、淋巴結轉移情況及病理分型相關.上述結論說明，在乳腺癌中高表達的MAL2基因，可促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移，且與患者不良預后相關[5-6]，據(jù)此推測MAL2可作為評估乳腺癌預后的重要因素.在進行GEPIA 生存分析時發(fā)現(xiàn)，MAL2高表達組總生存時間明顯低于低表達組，MAL2表達越高，乳腺癌患者預后越差，這為MAL2作為乳腺癌患者的預后因子提供了依據(jù).三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的重要亞型，預后較差，可細分為多種分子亞型，但MAL2基因與TNBC分子分型是否相關尚無報道.經Ualcan對TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，TNBC中基底樣1型的MAL2表達高于間充質干細胞型、骨髓干細胞型及未特指型，HER-2過表達型MAL2表達高于間充質干細胞型.基底樣1型的TNBC和HER-2過表達型的乳腺癌多存在組織學分級高、侵襲能力強的特點[20-21]，MAL2在這兩種分子分型中均呈高表達，原因可能是MAL2的多次跨膜可通過細胞內轉運的協(xié)同作用，改變細胞表面蛋白的表達和腫瘤細胞的整體功能[19].為明確MAL2在乳腺癌相關蛋白網絡中扮演何種角色及如何調控乳腺癌的惡性進展，Bhandari等[22]進行了相關研究，結果發(fā)現(xiàn)MAL2在乳腺癌中具有重要的生物學意義，其異常表達可預測乳腺癌的惡性進展，且MAL2對EMT也具有調節(jié)作用.此外，Zhong等[23]通過共表達分析發(fā)現(xiàn)了RRM2-let-7a-5p-SNHG16/MAL2信號網絡及與乳腺癌預后相關的ceRNA子網絡.本研究通過STRING分析發(fā)現(xiàn)包含TPD52、TPD52L2、YIF1A、IGR、FRMD4B、SH3YL1、OCLN等與MAL2相互作用節(jié)點數(shù)共有22個，其中TPD52、TPD52L2、OCLN與MAL2相互作用明顯.KEGG及GO分析發(fā)現(xiàn)MAL2主要參與補體和凝血級聯(lián)、細胞間緊密連接、白細胞經內皮細胞遷移等生物學過程，這為MAL2表達調控乳腺癌發(fā)展的研究提供了新思路.

本研究采用不同數(shù)據(jù)庫和在線分析工具分析了MAL2在乳腺癌中的差異表達，以及和乳腺癌預后的相關性.分析發(fā)現(xiàn)，MAL2在乳腺癌中的表達高于正常乳腺組織，與乳腺癌的不良預后密切相關，且參與乳腺癌惡性發(fā)展的調控過程.為驗證MAL2可作為潛在的乳腺癌預后因子以及其對乳腺癌的惡性發(fā)展具有調控作用，還需進行更多臨床及基礎機制方面的探索性研究.綜上，本研究認為MAL2基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有進一步研究的價值，這也為乳腺癌的預后評估及治療提供了新的思路.