長(zhǎng)鏈非編碼RNA FGD5-AS1通過(guò)miR-542-3p/GTPBP4對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響

陳新, 章諾貝

(1. 南昌大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江西 南昌 330000; 2. 南昌大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，江西 南昌 330000)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，是世界上第6大最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其死亡率居全球癌癥死亡率第3位[1-2].目前，放療是治療HCC常用的方法之一.然而，放射抗性的發(fā)生和發(fā)展已經(jīng)成為治療肝癌的主要臨床障礙[3].因此，提高肝癌細(xì)胞的對(duì)放射的敏感性是提升放療效果的有效途徑.

多項(xiàng)研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的對(duì)放射的敏感性中起著至關(guān)重要的作用[4-5].lncRNA SNHG1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，沉默SNHG18可以通過(guò)抑制信號(hào)素5A，提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性[6].lncRNA OIP5-AS1在耐輻射的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，沉默OIP5-AS1通過(guò)調(diào)控miR-369-3p/DYRK1A的表達(dá)以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞活性，抑制放射誘導(dǎo)的LoVo細(xì)胞凋亡[7].研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FGD5-ASl可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[8]，但其在腫瘤放射敏感性中的作用至今仍不清楚.

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[9].研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的放射敏感性中起關(guān)鍵作用[10].沉默miR-21可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性[11].沉默miR-214可以通過(guò)上調(diào)p38MAPK的表達(dá)，以增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性[12].過(guò)表達(dá)miR-133a可通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)從而增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性[13].研究發(fā)現(xiàn)，miR-542-3p可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲，但在腫瘤放射敏感性中的作用至今仍不清楚[14].本研究探究了lncRNA FGD5-AS1、miR-542-3p及其下游靶基因在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)以及在調(diào)控HCC放射敏感性中的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，并獲得所有患者的知情同意書(shū).21對(duì)HCC組織和癌旁組織取自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院的肝癌手術(shù)患者.所有患者經(jīng)組織病理學(xué)確診為肝癌，且術(shù)前未接受任何輔助治療.樣品儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及輻射

人肝細(xì)胞(LO2)和肝癌細(xì)胞系(Huh7、SMMC-7721、PLC5和Bel-7402)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).LO2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)中培養(yǎng).Huh7和PLC5細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)中培養(yǎng).將細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng).用X射線發(fā)生器(劑量率2 Gy/min)對(duì)細(xì)胞照射，Huh7和PLC5細(xì)胞給予0、2、4、6或8 Gy輻射劑量照射.

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

上海吉瑪公司構(gòu)建質(zhì)粒sh-GTPBP4、si-FGD5-AS1、miR-542-3p、anta-miR-542-3p及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒.使用PCR擴(kuò)增FGD5-AS1的全長(zhǎng)序列并克隆到pcDNA-3.1載體中，構(gòu)建pcDNA-FGD5-AS1質(zhì)粒用于過(guò)表達(dá)FGD5-AS1.采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將sh-GTPBP4、si-FGD5-AS1、miR-542-3p、anta-miR-542-3p、sh-NC、si-NC、miR-NC、anta-NC、pcDNA-FGD5-AS1和pcDNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Huh7和PLC5細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).本研究中所用的shRNA GTPBP4，siRNA FGD5-AS1和anta-miR-542-3p的序列見(jiàn)表1.

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從組織和細(xì)胞中分離總RNA.使用PrimeScriptTMRT試劑盒(美國(guó)Takara公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.在序列檢測(cè)系統(tǒng)(ABI Prism 7700；美國(guó)ABI公司)上使用PrimeScriptTMRT reagent kit(日本Takara公司)檢測(cè)基因的表達(dá)水平.通過(guò)TaqMan miRNA assay試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)分析miR-542-3p在組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平.使用β-actin作為FGD5-AS1和GTPBP4的內(nèi)參基因，U6作為miR-542-3p的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4的相對(duì)表達(dá)水平.本研究所用的引物序列見(jiàn)表2.

表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequence of RT-PCR

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

使用含有蛋白抑制劑的RIPA buffer(美國(guó)Solarbio公司)提取Huh7和PLC5細(xì)胞的總蛋白.使用Enhanced BCA Protein Assay Kit(上海Beyotime公司)檢測(cè)蛋白表達(dá).取30 μg蛋白樣品以質(zhì)量分?jǐn)?shù)14% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉后，將聚偏氟乙烯膜浸泡在一抗GTPBP4 (V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000，英國(guó)Abcam公司)和抗β-actin(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000，美國(guó)Boster公司)稀釋液二抗稀釋液(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶2 000,美國(guó)Boster公司)中，室溫孵育1 h；洗膜液洗膜后使用BeyoECL Plus(上海Beyotime公司)試劑盒顯色，以β-actin作為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，ImageJ(美國(guó)NIH Image公司)軟件分析蛋白條帶灰度值.

1.6 克隆形成試驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后，分別給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、2、4、6和8 Gy的輻射照射.細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，用甲醇固定15 min，并在室溫條件下使用結(jié)晶紫(美國(guó)Solarbio公司)染色20 min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞/克隆)，放射細(xì)胞存活曲線計(jì)算如下：存活分?jǐn)?shù)=處理組集落形成率/對(duì)照組集落形成率.

1.7 流式細(xì)胞儀分析

Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)分析Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡.轉(zhuǎn)染后，給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、6 Gy劑量照射，細(xì)胞離心后懸浮于1 × Annexin V Binding buffer(500 μL).Annexin V-FITC(5 μL)在黑暗條件下處理細(xì)胞5 min.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況.

1.8 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

擴(kuò)增野生型和突變型的GTPBP4 3′UTR區(qū)的堿基序列(包含miR-542-3p位點(diǎn))，并將其分別克隆到熒光素酶報(bào)告載體(pmiR-RB-Report)中構(gòu)建pmiR-GTPBP4-WT和pmiR-GTPBP4-MUT載體.同樣將野生型和突變型的FGD5-AS1 3′UTR區(qū)的堿基序列克隆到熒光素酶報(bào)告載體(pmiR-RB-Report)中構(gòu)建pmiR-FGD5-AS1-WT和pmiR-FGD5-AS1-MUT載體.將熒光素酶報(bào)告載體和miR-542-3p、anta-miR-542-3p、miR-NC和anta-NC共轉(zhuǎn)染人Huh7細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48 h后，用熒光素酶測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pharmingen公司)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的相對(duì)活性.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用student’sttest分析兩組組間的差異.多組組間差異采用單因素方差分析以及Tukey’s post hoc進(jìn)行檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

FGD5-AS1和GTPBP4的mRNA表達(dá)水平在肝癌組織中升高(P<0.01，圖1A、1C).相反，miR-542-3p在HCC組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.01，圖1B).此外，與人肝細(xì)胞(LO2)相比，F(xiàn)GD5-AS1和GTPBP4的mRNA表達(dá)水平在HCC細(xì)胞系顯著升高，miR-542-3p表達(dá)水平顯著降低(圖1D-1F).由此可見(jiàn)，在HCC組織和細(xì)胞中，F(xiàn)GD5-AS1和GTPBP4表達(dá)上調(diào)，miR-542-3p表達(dá)下調(diào).

2.2 下調(diào)GTPBP4可增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

為探討GTPBP4在HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用，通過(guò)向HCC細(xì)胞(Huh7和PLC5)中轉(zhuǎn)染sh-GTPBP4、sh-NC降低HCC細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá)水平.qRT-PCR和Western blot檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，與sh-NC組相比，sh-GTPBP4組中GTPBP4的mRNA和蛋白水平明顯降低(圖2A-2D).采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析了沉默GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞系放射敏感性的影響.用sh-GTPBP4或sh-NC轉(zhuǎn)染Huh7和PLC5細(xì)胞，分別給予0、2、4、6和8Gy的劑量照射.結(jié)果表明，沉默GTPBP4對(duì)Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力具有放射劑量依賴性的抑制作用(圖2E、2F).在沒(méi)有或存在放射線照射(6Gy)的情況下，敲除GTPBP4促進(jìn)了Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡(圖2G、2H).這些結(jié)果表明GTPBP4的下調(diào)可以增強(qiáng)HCC細(xì)胞的放射敏感性.

1)與癌旁組織比較，P<0.01；2)與人肝細(xì)胞比較，P<0.05；3)與人肝細(xì)胞比較，P<0.01.1)Compared with normal tissues,P<0.01;2)Compared with human hepatocyte cells,P<0.05；3)Compared with human hepatocyte cells,P<0.01qRT-PCR分析HCC組織中(A)FGD5-AS1、(B)miR-542-3p和(C)GTPBP4的表達(dá)水平.qRT-PCR分析HCC細(xì)胞(Huh7、SMMC-7721、PLC5和Bel-7402)中(D)FGD5-AS1、(E)miR-542-3p和(F)GTPBP4的表達(dá)水平qRT-PCR analysis of (A)FGD5-AS1, (B)miR-542-3p, and (C)GTPBP4 mRNA expression in HCC tissues. qRT-PCR analysis of (D) FGD5-AS1, (E)miR-542-3p, and (F)GTPBP4 mRNA expression in HCC cell lines (Huh7, SMMC-7721, PLC5, and Bel-7402).圖1 FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化Fig.1 Expression of FGD5-AS1, miR-542-3p, and GTPBP4 in HCC tissues and cell lines

2.3 下調(diào)FGD5-AS1可提高HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

與sh-NC組相比，sh-FGD5-AS1組Huh7和PLC5細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)顯著降低(圖3A、3B).轉(zhuǎn)染后，給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、2、4、6和8 Gy的劑量照射.克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明，射線照射后，F(xiàn)GD5-AS1下調(diào)可顯著降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力(圖3C、3D).在沒(méi)有或存在放射線照射(6 Gy)的情況下，F(xiàn)GD5-AS1的下調(diào)可以促進(jìn)Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡(圖3E、3F).由此可見(jiàn)，F(xiàn)GD5-AS1下調(diào)可增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性.

1)與sh-NC組比較，P<0.01.1)Compared with sh-NC，P<0.01.A-D：GTPBP4的mRNA和蛋白水平.E、F： Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力.G、H：sh-GTPBP4轉(zhuǎn)染后的Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡情況.A-D：the mRNA and protein levels of GTPBP4. E、F：The effect of GTPBP4 on the sensitivity of HCC cell lines. G、H： The effect of GTPBP4 on the sensitivity of HCC cell lines.圖2 下調(diào)GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.2 The effect of down-regulation of GTPBP4 on the radiosensitivity of HCC cells

1)與sh-NC組比較，P<0.011)Compared with sh-NC，P<0.01.A、B：用sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染Huh7和PLC5細(xì)胞后FGD5-AS1的表達(dá)水平；C、D：Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力；E、F：Huh7和PLC5細(xì)胞sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染后的凋亡情況A、B： Huh7 and PLC5 cells were transfected with sh- FGD5-AS1, and the expression of FGD5-AS1；C、D： The survival fractions of Huh7 and PLC5 cells；E、F：The apoptosis of Huh7 and PLC5 cells which were transfected with sh-FGD5-AS1圖3 下調(diào)FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.3 The effect of FGD5-AS1 down-regulation on the radiosensitivity of HCC cells

2.4 miR-542-3p靶向GTPBP4并抑制HCC GTPBP4的表達(dá)

使用Starbase v 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析預(yù)測(cè)GTPBP4的3′UTR包含一個(gè)miR-542-3p結(jié)合位點(diǎn)(圖4A).為了證實(shí)GTPBP4是否是miR-542-3p的靶基因，將GTPBP4-WT-3′UTR質(zhì)粒、GTPBP4-MUT-3″UTR質(zhì)粒與miR-542-3p、miR-NC共轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染48 h后，miR-542-3p可顯著降低pmiR-GTPBP4-WT載體的熒光活性.然而，含有pmiR-GTPBP4-MUT載體的熒光活性不受miR-542-3p的影響(圖4B).此外，與miR-NC組相比，miR-542-3p上調(diào)可顯著降低GTPBP4的mRNA和蛋白水平，而轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p則可顯著上調(diào)GTPBP4的mRNA和蛋白水平(圖4C、4D).這些結(jié)果表明miR-542-3p靶向GTPBP4，并抑制GTPBP4在HCC細(xì)胞中的表達(dá).

A：在GTPBP4 3′-UTR內(nèi)存在miR-542-3p的位點(diǎn).B：測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性，1)與pmiR-GTPBP4-MUT質(zhì)粒相比，P<0.01. C、D：qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白水平，2)與anta-miR-542-3p、anta-NC相比，P<0.01.A： The predicted miR-542-3p binding site within the GTPBP4 3′-UTR is shown. B： the luciferase activity was determined. Compared with pmiR-GTPBP4-MUT，P<0.01. C、D： the mRNA and protein levels of GTPBP4 were evaluated by qRT-PCR and Western blot. 2)Compared with anta- miR-542-3p and anta-NC，P<0.01.圖4 miR-542-3p直接靶向GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)的影響Fig.4 The effect of miR-542-3p directly targeting GTPBP4 on the expression of GTPBP4 in HCC cells

2.5 FGD5-AS1作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性促進(jìn)GTPBP4在HCC中的表達(dá)

使用Starbase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)FGD5-AS1基因序列上存在miR-542-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A).轉(zhuǎn)染FGD5-AS1的Huh7細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA的Huh7細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平(圖5B).將pmiR-FGD5-AS1-WT、pmiR-FGD5-AS1-MUT與miR-542-3p、miR-NC、anta-miR-542-3p、anta-NC共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞.Huh7細(xì)胞的FGD5-AS1-WT的熒光素酶活性在轉(zhuǎn)染miR-542-3p后減弱，而在轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p后增強(qiáng)，但miR-542-3p、miR-NC、anta-miR-542-3p、anta-NC對(duì)pmiR-FGD5-AS1-MUT熒光素酶活性無(wú)明顯影響(圖5C).使用pcDNA-FGD5-AS1-WT、pcDNA-FGD5-AS1-MUT、pcDNA、si-FGD5-AS1或si-NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)變化.結(jié)果表明野生型FGD5-AS1的過(guò)表達(dá)可顯著降低miR-542-3p的表達(dá)水平，而野生型FGD5-AS1的表達(dá)沉默可顯著升高miR-542-3p的表達(dá)水平(圖5D).野生型FGD5-AS1上調(diào)可促進(jìn)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高，而沉默野生型FGD5-AS1則可以導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低.突變型FGD5-AS1的上調(diào)對(duì)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]有影響(圖5E、5F).由此可見(jiàn)，F(xiàn)GD5-AS1可作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性上調(diào)Huh7細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá).

A：在FGD5-AS1的3′-UTR內(nèi)存在miR-542-3p的位點(diǎn).B：qRT-PCR檢測(cè)FGD5-AS1表達(dá)水平，1)與FGD5-AS1-MUT相比較，P<0.01.C：FGD5-AS1-WT熒光素酶活性,2)與FGD5-AS1-WT和anta-miR-542-3p共轉(zhuǎn)染相比較，P<0.01.D：qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)水平，3)與pcDNA相比較，P<0.01；qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)水平，4)與si-NC組相比較，P<0.01.E、F：qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，5)與pcDNA相比較，P<0.01；qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，6)與si-NC組相比較，P<0.01.A：The predicted binding sites of FGD5-AS1 and miR-542-3p is shown.B：the FGD5-AS1 expression level was confirmed by qRT-PCR 1) Compared with pcDNA- FGD5-AS1-MUT，P<0.01.C： the luciferase activity of FGD5-AS1-WT was measured 2)Compared with the cells were co-transfected with FGD5-AS1-WT and anta- miR-542-3p，P<0.01 D： the expression of miR-542-3p was examined by qRT-PCR 3) Compared with pcDNA，P<0.01. the expression of miR-542-3p was examined by qRT-PCR 4)Compared with si-NC，P<0.01. E、F： the mRNA and protein expression levels of GTPBP4 were determined by qRT-PCR and Western blot 5)Compared with pcDNA，P<0.01. the mRNA and protein expression levels of GTPBP4 were determined by qRT-PCR and Western blot 6)Compared with si-NC，P<0.01.圖5 FGD5-AS1作為miR-542-3p的“分子海綿”對(duì)GTPBP4在HCC細(xì)胞中表達(dá)的影響Fig.5 The effect of FGD5-AS1 as a “molecular sponge” of miR-542-3p on the expression of GTPBP4 in HCC cells

2.6 FGD5-AS1依賴于miR-542-3p影響HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

為了進(jìn)一步探討FGD5-AS1在影響HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用機(jī)制，在HuH7和PLC5細(xì)胞中進(jìn)行了恢復(fù)實(shí)驗(yàn).將si-FGD5-AS1、si-NC和anta-miR-542-3p、anta-NC共轉(zhuǎn)染HuH7和PLC5細(xì)胞后進(jìn)行放射線照射.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)miR-542-3p可以減輕si-FGD5-AS1對(duì)HuH7和PCL5細(xì)胞的克隆形成能力的抑制作用(圖6A、6B).此外，共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1和anta-miR-542-3p的HuH7和PCL5細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比明顯低于共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1和anta-NC的HuH7和PCL5細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比(圖6C、6D).由此可見(jiàn)，F(xiàn)GD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響依賴于miR-542-3p.

與si-FGD5-AS1和anta-NC共轉(zhuǎn)染組比較，1)P<0.05，2)P<0.01Compared with the cells were co-transfected with si-FGD5-AS1 and anta-NC，1)P<0.05，2)P<0.01A、B：Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力，C、D： Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡情況.A、 B： Clonogenic survivals of Huh7 and PLC5 cells were assessed after radiation, C、D： The apoptosis of Huh7 and PLC5 cells was analyzed by flow cytometry圖6 FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響依賴于miR-542-3pFig.6 The role of FGD5-AS1 in the radiosensitivity is dependent on miR-542-3p

3 討論

lncRNA FGD5-AS1位于染色體11q13.1上，可以作為miRNA的“分子海綿”調(diào)控基因的表達(dá).研究表明，F(xiàn)GD5-AS1參與多種癌癥的發(fā)展，例如乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌[8,15-16].有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GD5-AS1在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織[17].沉默F(xiàn)GD5-AS1可以上調(diào)miR-106b-3p的表達(dá)，抑制ATAD2的表達(dá)，進(jìn)而抑制K1和TPC1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)K1和TPC1細(xì)胞凋亡[18].近年來(lái)，多項(xiàng)研究證明，F(xiàn)GD5-AS1在腫瘤細(xì)胞輻射抗性的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用.沉默F(xiàn)GD5-AS1可以通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)caspase-3的表達(dá)，降低鼻咽癌細(xì)胞的克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性.此外，沉默F(xiàn)GD5-AS1可以通過(guò)調(diào)控miR-204/ZEB1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型，增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[19].然而，F(xiàn)GD5-AS1在HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用尚不清楚.在本研究中，F(xiàn)GD5-AS1在HCC組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào).此外，下調(diào)FGD5-AS1可以降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.

近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p在人類癌癥的發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[20-21].miR-542-3p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤分級(jí)和預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)[22].過(guò)表達(dá)miR-542-3p可以通過(guò)靶向MALAT-1抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23].此外，在腺樣囊性癌中，過(guò)表達(dá)miR-542-3p可以抑制Pim-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制SACC-83和SACC-LM細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[24].在本研究中，miR-542-3p在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).FGD5-AS1的過(guò)表達(dá)可顯著降低miR-542-3p的表達(dá)水平，而FGD5-AS1表達(dá)沉默則可顯著升高miR-542-3p的表達(dá)水平.下調(diào)miR-542-3p又可以減弱FGD5-AS1沉默對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的增強(qiáng)作用，此提示FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響作用依賴于miR-542-3p.

GTPBP4是一種屬于Ser/Thr蛋白激酶家族的酪氨酸激酶，是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞大小[25].學(xué)者認(rèn)為GTPBP4是一個(gè)潛在的惡性腫瘤治療靶點(diǎn)[26].GTPBP4抑制劑AZD1775可以減輕由輻射誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞G2的阻滯，并增強(qiáng)Hep3B、Huh7和HepG2細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性[25].此外，AZD1775治療可以抑制同源重組修復(fù)活性，上調(diào)γ-H2AX的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)奧拉帕利介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)輻射的增敏作用[27].在本研究中，GTPBP4在HCC組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默GTPBP4可以降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GTPBP4是miR-542-3p的靶基因，上調(diào)miR-542-3p可明顯降低GTPBP4的mRNA和蛋白水平，而轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p可明顯升高GTPBP4的mRNA和蛋白水平，miR-542-3p可靶向抑制GTPBP4的表達(dá).

FGD5-AS1上調(diào)可以促進(jìn)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高，而沉默F(xiàn)GD5-AS1則可以導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低.FGD5-AS1可作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性上調(diào)GTPBP4的表達(dá)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的放射敏感性的結(jié)論.

本研究證實(shí)FGD5-AS1和GTPBP4在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而miR-542-3p在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).功能分析發(fā)現(xiàn)FGD5-AS1沉默可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-542-3p/GTPBP4軸增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.本研究表明靶向FGD5-AS1可能成為肝癌放射治療的新靶點(diǎn).