一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定紅參中11種人參皂苷的含量

徐文武，謝 濤，呂東峰，楊 婷，張臻臻，魏西羽，孫 越，劉厚汝，李 偉，于德紅

一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定紅參中11種人參皂苷的含量

徐文武，謝 濤，呂東峰，楊 婷，張臻臻，魏西羽，孫 越，劉厚汝，李 偉*，于德紅*

華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063200

建立一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis single-marker，QAMS）測(cè)定紅參藥材中11種皂苷類成分的含量，為紅參質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。采用HPLC法，Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，體積流量1.3 mL/min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)203 nm。以人參皂苷Rb1為參照物，建立其與人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的相對(duì)校正因子，外標(biāo)法與QAMS分別測(cè)定11個(gè)成分含量。在一定線性范圍內(nèi)，人參皂苷Rb1相對(duì)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的相對(duì)校正因子重復(fù)性好，2種方法所得11種成分的含量無明顯差異，實(shí)驗(yàn)得相對(duì)校正因子可供參考。本研究建立的QAMS法，快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可為紅參藥材的質(zhì)量控制提供參考。

紅參；高效液相色譜法；一測(cè)多評(píng)；相對(duì)校正因子；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rf；人參皂苷Rh1；人參皂苷Rc；人參皂苷Ro；人參皂苷Rb2；人參皂苷Rb3；人參皂苷Rd；人參皂苷Rg3；質(zhì)量控制

人參C. A. Mey. 作為世界上最常用的草藥之一，已經(jīng)有幾千年的使用歷史。紅參是人參采收后經(jīng)過加工的產(chǎn)物，在《中國(guó)藥典》2020年版中紅參為五加科植物人參C. A. Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根及根莖，秋季采挖、洗凈、蒸制后，干燥[1]。紅參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、益氣攝血的功效，是歷史悠久的傳統(tǒng)名貴中藥材。紅參含有人參皂苷、多糖、脂肪酸和揮發(fā)油等多種活性成分，其中人參皂苷是紅參主要的生物活性成分，目前已經(jīng)從紅參中分離鑒定出了一百多種人參皂苷[2-4]，人參皂苷是評(píng)價(jià)紅參內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)。研究表明，人參皂苷具有抗炎[5]、抗腫瘤[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[8]、抗糖尿病[9]等藥理作用。

在紅參藥材質(zhì)量控制方面，《中國(guó)藥典》2020年版只對(duì)人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb13種人參皂苷含量做出規(guī)定，質(zhì)量控制指標(biāo)少。另外使用傳統(tǒng)的外標(biāo)法進(jìn)行人參皂苷的含量測(cè)定，存在實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、對(duì)照品稀缺昂貴等情況[10]。在本研究對(duì)紅參中主要人參皂苷（人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd）測(cè)定的同時(shí)，對(duì)紅參中稀有人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb3及人參皂苷Rg3進(jìn)行測(cè)定，且針對(duì)傳統(tǒng)使用的外標(biāo)法操作繁瑣、對(duì)照品昂貴稀缺等情況，本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法（QAMS）同時(shí)測(cè)定紅參中11種人參皂苷的含量，不僅可以節(jié)省對(duì)照品用量，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，還可以更加全面地評(píng)價(jià)紅參質(zhì)量，為紅參的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201832，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.4%）、人參皂苷Re（批號(hào)110754-201827，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.4%）、人參皂苷Rb1（批號(hào)110704-201827，91.2%）、人參皂苷Rb2（批號(hào)111715-201203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.8%）、人參皂苷Rd（批號(hào)111818-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.1%）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rf（批號(hào)100269-201903）、人參皂苷Rc（批號(hào)110006-201810）、人參皂苷Ro（批號(hào)180002- 202005）、人參皂苷Rb3（批號(hào)200613- 201906）、人參皂苷Rg3（批號(hào)100274-201908）人參皂苷Rh1（批號(hào)160010-201904）對(duì)照品購(gòu)自南京源植生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；紅參藥材來源見表1，經(jīng)華北理工大學(xué)藥學(xué)院于德紅教授鑒定為五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根及根莖。

1.2 儀器

Shimadzu LC-2030高效液相色譜儀，LC Solution色譜工作站（日本島津公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YS-04小型高速粉碎機(jī)（北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司）；ME155DU/02十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。甲醇、乙腈均為液相色譜級(jí)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～30 min，19% A；30～35 min，19%～24% A；35～80 min，24%～40% A；80～100 min，40%～49% A；體積流量 1.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL。HPLC圖譜見圖1。

1-人參皂苷Rg1 2-人參皂苷Re 3-人參皂苷Rf 4-人參皂苷Rh1 5-人參皂苷Rb1 6-人參皂苷Rc 7-人參皂苷Ro 8-人參皂苷Rb2 9-人參皂苷Rb3 10-人參皂苷Rd 11-人參皂苷Rg3

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.115、0.100、0.081、0.050、0.102、0.105、0.140、0.140、0.080、0.095、0.056 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。放于冰箱4 ℃保存、備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取紅參（粉碎后過四號(hào)篩）粉末1 g，用濾紙包裹后放入索氏提取器中，加適量三氯甲烷，75 ℃加熱回流3 h后，棄去三氯甲烷液，待藥渣溶劑揮干，同濾紙筒轉(zhuǎn)移到具塞錐形瓶中，再精密量取水飽正丁醇50 mL加入錐形瓶，密塞，放置過夜，超聲處理30 min，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻、過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、10、20 μL注入高效液相色譜儀，平行3針，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄相應(yīng)的色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的回歸方程及線性范圍。結(jié)果表明11個(gè)成分的線性關(guān)系良好，如表2所示。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品10 μL，按“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，在同一日內(nèi)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰面積值，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3峰面積的RSD分別為0.84%、1.32%、0.75%、0.88%、0.79%、1.47%、0.64%、0.46%、0.91%、1.47%、0.81%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紅參藥材（批號(hào)20181125）按“2.3”供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，每次進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.372、0.637、0.573、0.136、3.679、1.838、1.936、1.149、0.083、0.569、0.086 mg/g，RSD分別為1.85%、2.63%、2.59%、1.10%、2.96%、2.20%、2.92%、2.33%、1.62%、1.24%、2.56%，表明該方法的重復(fù)性良好。

表2 11個(gè)人參皂苷成分回歸方程與線性范圍

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份紅參供試品溶液（批號(hào)20181125），室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在上述色譜條件下測(cè)定，每次進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。計(jì)算得，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3峰面積的RSD分別為0.75%、0.88%、0.34%、0.91%、1.63%、1.43%、2.58%、0.88%、0.94%、1.71%、1.83%，表明溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定紅參（批號(hào)20181125，相當(dāng)于含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3分別為1.186、0.318、0.286、0.068、1.839、0.919、0.499、0.574、0.041、0.284、0.043 mg）粉末0.5 g，平行稱取6份，以藥材中各成分-對(duì)照品量（1∶1）的比例加入一定量的對(duì)照品，再按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定11種人參皂苷的峰面積，并計(jì)算出相應(yīng)的加樣回收率和RSD。人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的加樣回收率分別為100.60%、99.15%、101.82%、98.95%、101.93%、98.30%、100.52%、99.57%、98.54%、102.59%、101.74%，RSD分別為1.65%、1.43%、1.57%、1.12%、1.96%、1.21%、2.24%、1.68%、1.57%、1.12%、2.41%。

2.5 相對(duì)校正因子（f）的確定

校正因子的計(jì)算按線性關(guān)系考察項(xiàng)下的試驗(yàn)方法，＝f/s＝(A/W)/(s/s)[11]，A為待測(cè)成分的峰面積，W為待測(cè)成分的質(zhì)量；s為內(nèi)參物s的峰面積，s為內(nèi)參物s的質(zhì)量。取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，進(jìn)樣體積1、2、4、6、8、10、15、20 μL下，分別計(jì)算人參皂苷Rb1、Ro作為內(nèi)參物時(shí)，11種人參皂苷的，并將結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表4、5。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1和人參皂苷Ro作為內(nèi)參物時(shí)RSD均小于3%符合實(shí)驗(yàn)要求，根據(jù)價(jià)廉易得的原則本實(shí)驗(yàn)選取人參皂苷Rb1作為內(nèi)參物。

表4 人參皂苷Rb1作為內(nèi)參物各成分f

表5 人參皂苷Ro作為內(nèi)參物各成分f

2.6 f的耐用性評(píng)價(jià)

2.6.1 不同色譜柱系統(tǒng)對(duì)的影響 實(shí)驗(yàn)采用Shimadzu LC-2030高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，分別考察了3根不同廠家的色譜柱（Agilent XDB C18、Waters sunfire C18、H＆E ODS C18）對(duì)各人參皂苷的影響，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg3的RSD依次為1.22%、1.62%、1.30%、2.70%、1.30%、1.63%、1.08%、0.91%、0.99%、1.75%，表明不同色譜系統(tǒng)及不同色譜柱對(duì)各成分無顯著性影響，結(jié)果見表6。

2.6.2 柱溫對(duì)的影響 實(shí)驗(yàn)采用Shimadzu LC-2030高效液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察不同柱溫（28、30、32、34 ℃）對(duì)的影響，結(jié)果顯示各成分的RSD均小于3%，表明柱溫對(duì)各成分的無顯著影響，結(jié)果見表7。

表6 不同色譜柱系統(tǒng)對(duì)f的影響

表7 不同柱溫對(duì)f的影響

2.6.3 不同流動(dòng)相體積流量對(duì)的影響 實(shí)驗(yàn)采用Shimadzu LC-2030高效液相色譜儀系統(tǒng)，Agilent XDB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察了不同體積流量（1.0、1.1、1.2、1.3 mL/min）對(duì)的影響，各成分的RSD均小于3%，表明不同體積流量對(duì)各成分無顯著影響，結(jié)果見表8。

表8 不同體積流量對(duì)f的影響

2.7 待測(cè)成分色譜峰的定位

在QAMS的運(yùn)用中，目前常用的色譜峰定位方法有相對(duì)保留值法、保留時(shí)間差、時(shí)間校正法、對(duì)照提取物法等。保留時(shí)間差法計(jì)算公式：Δt/s=t－s。相對(duì)保留值計(jì)算公式：t/s=t/s。本實(shí)驗(yàn)選取相對(duì)保留值作為色譜峰的定位方法[12-13]。本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行待測(cè)組分色譜峰的定位，采用Shimadzu LC-2030高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，分別考察了3根不同廠家的色譜柱（Agilent XDB C18、Waters sunfire C18、H＆E ODS-A C18）中各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間。測(cè)定結(jié)果為Rg1/Rb1＝0.6040、Re/Rb1＝0.6165、Rf/Rb1＝0.8548、Rh1/Rb1＝0.9598、Rc/Rb1＝1.0425、Ro/Rb1＝1.0499、Rb2/Rb1＝1.0828、Rb3/Rb1＝1.0975、Rd/Rb1＝1.1630、Rg3/Rb1＝1.5656，波動(dòng)較小，RSD分別為0.342 2%、1.217 5%、0.954 9%、0.643 8%、0.374 0%、1.005 9%、0.357 8%、0.381 3%、0.250 8%、0.284 2%均小于3%，無顯著性差異，如表9所示。

2.8 QAMS和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

10批紅參藥材，按“2.3”項(xiàng)下供試品制備方法，“2.1”項(xiàng)下方法分析，采用QAMS與外標(biāo)法分別計(jì)算各成分含量，QAMS定量計(jì)算公式如下。w＝(s×A)/(×s)，s為參照物峰面積，s為參照物量；A為待測(cè)成分峰面積，w為待測(cè)成分量；為參照物與待測(cè)成分[14-15]，將QAMS計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行配對(duì)檢驗(yàn)，結(jié)果值均＞0.05，表明2種測(cè)定方法的結(jié)果無顯著性差異，結(jié)果見表10。

表9 相對(duì)保留時(shí)間

表10 QAMS與外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的考察

本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相磷酸水比例，流動(dòng)相體積流量，在流動(dòng)相磷酸水比例選取方面考察了乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水以及乙腈-水3種比例，結(jié)果在乙腈-0.05%磷酸水和乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，基線出現(xiàn)較大漂移，而以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相基線穩(wěn)定性好且峰形尖銳。在流動(dòng)相體積流量方面，考察了1.0、1.1、1.2、1.3 mL/min 4種體積流量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前3種體積流量人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的峰沒能得到完全分離，在體積流量為1.3 mL/min時(shí)人參皂苷Rg1與人參皂苷Re得到有效分離，且其它各成分峰形均較好。因此本實(shí)驗(yàn)在乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相的基礎(chǔ)上設(shè)定流動(dòng)相體積流量為1.3 mL/min。

3.2 紅參QAMS質(zhì)量評(píng)價(jià)

在紅參的質(zhì)量控制方面，《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定紅參中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量不少于0.25%，人參皂苷Rb1含量不少于0.20%。本研究在此基礎(chǔ)上，采用QAMS同時(shí)測(cè)定了11種人參皂苷的含量，并且其中人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rg3是紅參中稀有皂苷，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定可以更好的全面評(píng)價(jià)紅參的質(zhì)量。QAMS含量測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明QAMS測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，因此可用QAMS代替外標(biāo)法對(duì)紅參中人參皂苷進(jìn)行含量測(cè)定，采用QAMS可用一個(gè)內(nèi)參物即可求得其它成分的含量，在節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本的同時(shí)，也減少了科研人員的時(shí)間成本，更加快速準(zhǔn)確的對(duì)紅參質(zhì)量做出評(píng)價(jià)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[12] 譚詩涵, 伍紅年, 雷雅婷, 等. 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定竹節(jié)參中7種皂苷類成分的含量 [J]. 中草藥, 2019, 50(17): 4164-4169.

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Simultaneous determination of 11 saponins components in red ginseng by QAMS method

XU Wen-wu, XIE Tao, LV Dong-feng, YANG Ting, ZHANG Zhen-zhen, WEI Xi-yu,SUN Yue, LIU Hou-ru, LI Wei, YU De-hong

School of Pharmacy, North China University of Science and Technology, Tangshan 063200, China

To establish a quantitative analysis of multi-components by single maker (QAMS) for the content determination of eleven saponins in red ginseng, so as to provide a scientific basis for the quality control of red ginseng,. Methods The HPLC analysis was performed on Agilent C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), using acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase at a flow rate of 1.3 mL/min, and column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 203 nm. Ginsenoside Rb1was used as reference to establish its relative correction factor of Rg1, Re, Rf, Rh1, Rc, Ro, Rb2, Rb3, Rd and Rg3. The contents of eleven components were determined by both external standard method and QAMS.Within a certain linear range, ginsenoside Rb1 had better reproducibility than ginsenoside Rg1, Re, Rf, Rh1, Rc, Ro, Rb2, Rb3, Rd, and Rg3in terms of relative correction factors. There was no significant difference in the contents of 11 components obtained by the two methods. The relative correction factors obtained in the experiment could be used for reference.The establishment of multi-components by single maker method in this study is rapid, simple and reproducible, which can provide reference for the quality control of red ginseng.

red ginseng; HPLC; quantitative analysis of multi components with a single marker; relative correction factor; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rf; ginsenoside Rh1; ginsenoside Rc; ginsenoside Ro; ginsenoside Rb2; ginsenoside Rb3; ginsenoside Rd; ginsenoside Rg3quality control

R286

A

0253 - 2670(2021)07 - 2099 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.027

2020-09-06

華北理工大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（No.28418499）

徐文武（1993—），在讀碩士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail: 1150403761@qq.com

李 偉（1977—），研究員，研究方向?yàn)樗幬锓治雠c藥物代謝動(dòng)力學(xué)。E-mail: liwei@ncst.edu.cn

于德紅（1971—），副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: ydh613@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]