基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用機制

曹 建，朱曉燃，楊振寰，索菲婭，姚樹坤, , 3*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用機制

曹 建1，朱曉燃2，楊振寰2，索菲婭2，姚樹坤1, 2, 3*

1. 北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院，北京 100191 2. 北京中醫(yī)藥大學，北京 100029 3. 中日友好醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100029

探討清肝化瘀顆粒治療肝癌的有效成分、作用靶點及可能作用機制。通過中藥與疾病數(shù)據(jù)庫，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學工具篩選清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要有效成分與作用靶點，分析作用靶點的分子機制，構(gòu)建“中藥-成分-靶點-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。采用體內(nèi)外實驗驗證清肝化瘀顆粒核心有效成分苦參堿對肝癌細胞學行為的作用，并檢測苦參堿對核心靶點及主要信號通路的調(diào)節(jié)作用。共篩選出清肝化瘀顆粒治療肝癌的潛在作用靶點86個，富集分析結(jié)果顯示作用靶點共涉及生物過程20種，細胞組成15種，分子功能20種，以及信號通路20條。利用構(gòu)建的“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)清肝化瘀顆粒主要通過槲皮素、木犀草素及苦參堿對腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）及G1/S期特異細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）等核心靶點參與細胞凋亡及細胞自噬等與肝癌有關(guān)的腫瘤生物學行為發(fā)揮治療肝癌的作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)，清肝化瘀顆粒有效成分苦參堿以劑量相關(guān)的方式抑制肝癌細胞的增殖，促進肝癌細胞凋亡，并能調(diào)節(jié)肝癌細胞氧化應(yīng)激脅迫標志物，同時可對TP53、VEGFA及CCND1等核心靶點的表達量進行調(diào)節(jié)。肝癌荷瘤裸鼠實驗發(fā)現(xiàn)苦參堿對人肝癌細胞HepG2荷瘤裸鼠具有抑瘤作用，并誘導肝癌細胞凋亡，同時能調(diào)節(jié)線粒體自噬及線粒體分裂2種線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程相關(guān)蛋白的表達量。清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要機制包括以槲皮素、木犀草素及苦參堿為代表的多成分，以TP53、VEGFA及CCND1為代表的多靶點，以細胞凋亡、線粒體穩(wěn)態(tài)及氧化應(yīng)激為代表的多通路調(diào)節(jié)的系統(tǒng)性、協(xié)同性作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學；清肝化瘀顆粒；肝癌；苦參堿；分子機制；槲皮素；木犀草素

肝癌目前已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)第6大常見癌癥，其致死率位居全球第4[1]。我國是肝癌大國，在全球肝癌的發(fā)病中，肝癌的發(fā)病率為46.6%，病死率為47.1%[2]。在我國肝癌的年齡標準化的5年生存率僅為12.1%[3]，因此，我國的肝癌防治工作在全球肝癌的防治工作中占據(jù)舉足輕重的位置。肝癌起病隱匿，致死率高，大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已進展至中晚期，其發(fā)病率與死亡率之比接近1，在全世界范圍內(nèi)造成了廣泛的醫(yī)療負擔與社會負擔[4]。外科手術(shù)切除目前仍是肝癌患者的最佳治療手段，但是這種治療手段對肝癌患者所處的分期與肝臟功能要求較高，且受到遠期療效與復發(fā)風險的局限[5]。因此，繼續(xù)探索與研發(fā)有效的肝癌治療策略很有必要。

隨著我國中醫(yī)藥學的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥參與到癌癥臨床治療的各個階段[6]，發(fā)揮著減輕治療手段的毒副反應(yīng)、提高癌癥治療效果、延長癌癥患者生存期、提高癌癥患者治療后生存質(zhì)量等重要作用[7-8]。清肝化瘀顆粒是本課題組將多年肝癌臨證經(jīng)驗總結(jié)的經(jīng)驗方，由黃芩、苦參、白術(shù)、莪術(shù)、白花蛇舌草、半枝蓮、三棱及甘草8味中藥組成[9]，臨床實踐顯示出較好的肝癌治療效果[10]，前期的臨床前研究也揭示了其在抑制肝癌細胞增殖中可能的細胞學與分子生物學機制[11-12]。清肝化瘀顆粒組方有效成分眾多，作用靶點與靶信號通路相互作用機制復雜，其在抑制肝癌中的具體分子機制尚待闡明。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學工具預測了清肝化瘀顆粒治療肝癌的潛在有效成分、作用靶點及信號通路，并通過體內(nèi)外實驗進一步驗證了清肝化瘀顆粒主要有效成分苦參堿的作用及其對核心靶點的調(diào)節(jié)作用，旨在揭示清肝化瘀顆粒在肝癌中發(fā)揮治療效果的可能有效成分及其分子機制，為其進一步的臨床前研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點的收集與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php，version2.3）[13]進行數(shù)據(jù)挖掘，收集清肝化瘀顆粒組方8味中藥的有效成分與作用靶點。通過對既往中藥活性成分的藥物代謝動力學研究結(jié)果分析[14]，本研究將人體口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，腸上皮Caco-2細胞滲透性＞0 nm/s，半衰期（half-time，HL）≥4 h，氫鍵供體數(shù)目（Hdon）＜5個及氫鍵受體數(shù)目（Hacc）＜10個設(shè)置為有效成分的篩選參數(shù)。

同時利用肝癌數(shù)據(jù)庫OncoDB.HCC（http:// oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm）[15]及Liverome（http:// liverome.kobic.re.kr/index.php）[16]中的肝癌基因組數(shù)據(jù)對肝癌相關(guān)靶點進行搜集與篩選。基于實驗設(shè)計，本研究納入OncoDB.HCC數(shù)據(jù)庫中的所有靶點及Liverome數(shù)據(jù)庫中差異表達譜證據(jù)≥5條的靶點作為肝癌疾病靶點。

將以上兩者預測的靶點結(jié)果取交集，進一步確認清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用靶點?；诖俗饔冒悬c集合，運用STRING（https://string-db.org/，version 11.0）及Cytoscape（version 3.7.2）軟件進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，利用MCODE插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)中的分子相互作用模塊，根據(jù)實驗設(shè)計，篩選條件設(shè)置為度值臨界值（degree cutoff）＝2，K核（K-core）＝2。同時利用CytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點進行研究，根據(jù)實驗設(shè)計，本研究選擇最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）算法獲取核心靶點信息并按照重要度大小對其進行排序。

將篩選得到的作用靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫，設(shè)定參數(shù)為最小重疊度（min overlap）＝3，P臨界值（P cutoff）＝0.01，最小富集度（min enrichment）＝1.5，對作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及基因本體（gene ontology，GO）富集分析，并使用R語言（version 3.0.6）中的ggplot2（version 3.3.0）程序包對富集分析的結(jié)果進行可視化，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對靶向信號通路示意圖進行繪制。

1.2 中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將所獲得的清肝化瘀顆粒組方中藥的有效成分及所獲取的作用靶點與信號通路分別導入Cytoscape軟件，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖并利用網(wǎng)絡(luò)分析（network analyzer）功能對網(wǎng)絡(luò)圖的特征進行分析，并獲取主要有效成分及核心靶點信息。

1.3 分子生物學實驗驗證

1.3.1 材料 HepG2細胞系購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；分析純級苦參堿（貨號M5319）購自Sigma-Aldrich公司。

1.3.2 細胞模型構(gòu)建與細胞培養(yǎng) 將HepG2細胞以含10%胎牛血清（購自GIBCO，貨號10270-106）的RPMI 1640培養(yǎng)基（購自GIBCO，貨號11875093）置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8細胞活力檢測 使用Cell Counting Kit-8（購自Dojindo，日本，CK04）進行CCK-8細胞活力檢測。收集對數(shù)生長期細胞，按3×103個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后使用等量的不同濃度的苦參堿（1、5、10 nmol/L）給藥并繼續(xù)培養(yǎng)12 h，同時設(shè)置等量的不含苦參堿培養(yǎng)基處理的細胞作為對照組。每組設(shè)置3個重復孔。中止培養(yǎng)后，每個培養(yǎng)孔加入CCK-8溶液10 μL，避免引入氣泡，同時設(shè)置不加細胞，僅添加不同濃度藥物及CCK-8溶液的培養(yǎng)孔作為空白組。在培養(yǎng)箱中孵育4 h，將培養(yǎng)板置于酶標儀上，于450 nm處測定各孔的吸光度（），并按照下述公式計算細胞的生存率。同時確定苦參堿對HepG2細胞的最小抑制濃度。

細胞生存率＝(苦參堿－空白)/(對照－空白)

1.3.4 細胞凋亡檢測 使用Annexin V，F(xiàn)ITC Apoptosis Detection Kit（購自Donjindo，日本，AD10）進行細胞凋亡檢測。肝癌細胞的收集與接種按照“1.3.3”項下方法進行，實驗分為4組，分別為對照組（等量的不含苦參堿的培養(yǎng)基處理）、苦參堿組（給藥濃度采用“1.3.3”項下確定的苦參堿對HepG2細胞的最小抑制濃度）、苦參堿聯(lián)合細胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK組（z-VAD-FMK濃度為10 μmol/L，苦參堿給藥濃度與苦參堿組相同）、z-VAD-FMK組（僅添加10 μmol/L z-VAD-FMK）。收集細胞后加入10倍體積的Annexin V結(jié)合溶液，重懸細胞使細胞終濃度為1×106個/mL。吸取100 μL細胞懸液加入到新的流式管中，加入5 μL Annexin，F(xiàn)ITC聚合物，隨后加入5 μL PI溶液。室溫條件下，避光，孵育15 min，在流式管中加入10倍體積的Annexin V結(jié)合溶液，在流式細胞儀中上機檢測。

1.3.5 細胞氧化應(yīng)激標志物檢測 使用總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號S0052）及總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（購自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號S0101）進行細胞氧化應(yīng)激標志物檢測。肝癌細胞的收集與接種按照“1.3.3”項下方法進行，苦參堿組給藥濃度為1、5 nmol/L，同時設(shè)置等量的不含苦參堿的培養(yǎng)基處理的HepG2細胞作為對照組。收集細胞后按照試劑盒說明書進行細胞裂解、檢測體系構(gòu)建及后續(xù)反應(yīng)，最后分別在酶標儀412 nm及450 nm處記錄并計算GSH及SOD的活性變化程度。

1.3.6 ELISA法檢測血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）含量 使用VEGFA定量檢測試劑盒（購自R&D SYSTEMS，SVE00）進行VEGFA檢測。肝癌細胞的收集、接種及給藥按照“1.3.5”項下方法進行。收集細胞后按照試劑盒說明書進行細胞裂解、檢測體系構(gòu)建及后續(xù)反應(yīng)，中止反應(yīng)后將反應(yīng)體系置于酶標儀450 nm處測定并計算VEGFA的含量。

1.3.7 Western blotting檢測相關(guān)蛋白水平 肝癌細胞的收集、接種及給藥按照“1.3.3”項下方法進行。各組細胞提取總蛋白后，利用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（購自Solarbio，PC0020）對其濃度進行測定。使用濃度為10%的SDS-PAGE蛋白電泳后將目的條帶轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上。使用一抗在4 ℃下孵育過夜后，用TBST緩沖液清洗3次，與二抗室溫下孵育1 h。使用化學發(fā)光法對凝膠圖像進行顯影及定影，并進行掃描存檔。本研究中使用的第一抗體信息：抗腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）抗體（Abcam，ab26），抗G1/S期特異細胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）抗體（Abcam，ab16663）；內(nèi)參蛋白第一抗體信息：抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（CST，5174）；第二抗體信息：羊抗鼠-辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）（CST，7076），羊抗兔-HRP（CST，7074）。

1.4 肝癌細胞移植瘤動物模型實驗驗證

1.4.1 肝癌細胞移植瘤動物模型的建立、分組與給藥 雄性SPF級BALB/C裸鼠，6周齡，實驗開始時體質(zhì)量（17.6±2.3）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。所有裸鼠分籠飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF級動物實驗平臺，采用12 h光/暗周期，自由攝食飲水，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，取材前12 h禁食。肝癌細胞移植瘤動物模型的建立與分組參考朱丹丹等[17]的方法，隨機分為對照組和苦參堿給藥組，每組各5只。收集對數(shù)生長期的HepG2人肝癌細胞，調(diào)整濃度至5×107個/mL，使用一次性注射器將細胞sc至裸鼠右側(cè)腋窩，0.1 mL/只，連續(xù)10 d，瘤塊長至約5 mm×5 mm×5 mm認為造模成功。對照組ip生理鹽水1 mL，1次/d，參考朱丹丹等[17]前期的研究結(jié)果，苦參堿給藥組用藥劑量為50 mg/kg，ip 1.0 mg/mL苦參堿溶液1 mL，1次/d。連續(xù)給藥28 d。

1.4.2 移植瘤瘤體HE染色病理檢查 將裸鼠瘤塊剝離后置于標記編號的包埋盒中，利用乙醇逐級脫水，二甲苯透明，并于58～60 ℃的石蠟中浸蠟，包埋，4 ℃過夜后置于切片機上，厚度調(diào)整為4 μm，連續(xù)切片，60 ℃烤片后脫蠟，使用蘇木素及0.5%伊紅染液染色，利用中性樹膠封片后置于顯微鏡下采集圖像。

1.4.3 移植瘤瘤體TUNEL染色法檢測細胞凋亡 石蠟切片脫蠟后利用PBS溶液漂洗3次，并將切片置于煮沸的抗原修復液中修復抗原10 min，冷卻至室溫后加入100 μL蛋白酶K，濕盒中透明20 min，PBS漂洗后于3% H2O2溶液中孵育封閉10 min，加入100 μL陽性片孵育液，37 ℃濕盒孵育30 min，滴加50 μL標記反應(yīng)液，37 ℃濕盒孵育90 min，加入PI染液50 μL，室溫反應(yīng)5 min，60 ℃烘箱中干燥后，使用含DAPI的抗熒光猝滅封片劑封片，置于顯微鏡下采集圖像。

1.4.4 免疫組化及Western blotting法檢測苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子的表達水平 石蠟切片脫蠟后利用PBS溶液漂洗3次，并將切片置于煮沸的抗原修復液中修復抗原10 min，使用免疫組化筆圈定待測組織區(qū)域，區(qū)域內(nèi)加100 μL的3%H2O2，孵育10 min，加入100 μL封閉液，室溫條件下于濕盒中孵育1 h，加入一抗后，4 ℃濕盒中孵育過夜，PBS沖洗后加入二抗，室溫條件下濕盒中孵育1 h，以1∶100的體積比加入適量HRP標記的鏈霉親和素，室溫濕盒中孵育30 min，加入100 μL新鮮配制的DAB顯色液，室溫孵育7 min，加入蘇木素染色液染色7 min，隨后放入自來水10 min進行返藍，置于60 ℃烘箱中干燥后封片并置于顯微鏡下拍照。Western blotting實驗方法采用“1.3.7”項下方法。第一抗體信息：抗MST1抗體（Genetex，GTX109294），抗Parkin抗體（Bioworld，BS91016），抗哺乳動物不育系20樣激酶1（mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1）抗體（Genetex，GTX109294），抗磷酸化的c-Jun氨基末端激酶（p-c-Jun-terminal kinase，p-JNK）抗體（CST，4668T），抗PTEN誘導的激酶1（PTEN-induced kinase 1，PINK1）抗體（Bioworld，BS91075），抗Parkin抗體（Bioworld，BS91016）；第二抗體信息：羊抗兔IgG（H＋L）HRP（Bioworld，BS13278），羊抗兔-HRP（CST，7074）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點獲取及“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究經(jīng)數(shù)據(jù)挖掘得到清肝化瘀顆粒有效成分161種，其中重復成分17種，包含于2味中藥的重復成分12種，包含于3味中藥的重復成分2種，包含于4味中藥的重復成分3種。同時獲得上述有效成分對應(yīng)的靶點276個。利用肝癌數(shù)據(jù)庫Liverome及OncoDB.HCC數(shù)據(jù)庫共收集得到994個肝癌疾病靶點。將獲得的清肝化瘀顆粒有效成分作用靶點及肝癌疾病靶點相互映射，得到86個交集靶點，即為清肝化瘀顆粒治療肝癌潛在作用靶點。將共有靶點所對應(yīng)的中藥、有效成分與對應(yīng)的疾病信息導入Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

KuS-苦參 BanZL-半枝蓮 HuangQ-黃芩 BaiZ-白術(shù) SheSC-白花蛇舌草 GanC-甘草 SanL-三棱 Ezh-莪術(shù) HCC-肝癌

“中藥-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)包括中藥節(jié)點8個（圖中以正方形顯示），組方中藥有效成分節(jié)點136個（圖中以圓形顯示），靶點節(jié)點86個（圖中以菱形顯示），疾病節(jié)點1個（圖中以三角形顯示），以及1299種“中藥-成分-靶點-疾病”對應(yīng)關(guān)系（圖中以黑色直線顯示）。在中藥水平，對應(yīng)有效成分數(shù)目由多到少的中藥分別為甘草（83種有效成分）、黃芩（28種有效成分）、苦參（20種有效成分）、半枝蓮（18種有效成分）、白花蛇舌草及三棱（各4種有效成分）、白術(shù)及莪術(shù)（各1種有效成分）。在化合物水平，按對應(yīng)治療肝癌的靶點數(shù)目由多到少的化合物有槲皮素（對應(yīng)59個靶點），木犀草素（對應(yīng)24個靶點）及苦參堿（對應(yīng)16個靶點）等。在靶點蛋白層面，連接化合物數(shù)目較高的靶點有9×104熱休克蛋白αA1（HSP90AA1，對應(yīng)有效成分105種）、TP53（對應(yīng)有效成分93種）及VEGFA（連接化合物數(shù)目60種）等，86個靶點節(jié)點中，有46個節(jié)點與2個及2個以上的化合物相連接，占全部靶點的53.5%。清肝化瘀顆粒組方中藥治療肝癌作用靶點蛋白數(shù)目如下：苦參治療肝癌靶點數(shù)目為70個（占苦參預測靶點總數(shù)的34.8%，下同），黃芩31個（25.2%），白術(shù)2個（10.5%），莪術(shù)4個（18.2%），半枝蓮72個（32.3%），白花蛇舌草62個（33.9%），三棱15個（18.8%），甘草75個（32.8%）。該網(wǎng)絡(luò)中，每味中藥對應(yīng)平均靶點數(shù)目為10.75，每種中藥成分對應(yīng)的平均靶點數(shù)量0.63，每個靶點平均對應(yīng)成分1.58個。

2.2 清肝化瘀顆粒治療肝癌核心靶點的篩選與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫及MCODE和cytoHubba插件對清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點進行篩選。如圖2所示，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，評分較高的核心靶點有TP53、CCND1、VEGFA、原癌基因蛋白c-myc（proto-oncogene protein c-myc，MYC）及信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等，以上作用靶點均為PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高且受到多味中藥及有效成分調(diào)節(jié)的靶點蛋白。

圖2 清肝化瘀顆粒治療肝癌的核心靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點的生物學過程分析

利用在線生物信息學數(shù)據(jù)庫Metascape對得到的清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點基因進行GO功能注釋分析。如圖3所示，GO生物學途徑分析得到20個條目，分別為細胞因子介導的信號通路（29個靶點參與）、氧含量響應(yīng)途徑（23個靶點參與）及細胞凋亡信號通路（20個靶點參與）等。GO細胞組分分析共得到15個條目，分別為細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物（8個靶點參與）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（7個靶點參與）及線粒體膜（10個靶點參與）等。GO分子功能分析共得到20個條目，分別為激酶結(jié)合功能（21個靶點參與）、激酶調(diào)節(jié)活性（12個靶點參與）及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合功能（9個靶點參與）等。KEGG代謝信號通路富集分析得到20個條目，分別為癌癥相關(guān)通路（34個靶點參與）、含鉑類藥物耐藥性相關(guān)通路（13個靶點參與）及P53信號通路（12個靶點參與）等。

根據(jù)本課題的研究內(nèi)容，選取了腫瘤相關(guān)通路（pathways in cancer，hsa05200）、肝癌相關(guān)信號通路（hepatocellular carcinoma，hsa05225）、細胞凋亡信號通路（apoptosis，hsa04210）、動物細胞自噬信號通路（autophagy-animal，hsa04140）及動物細胞線粒體自噬信號通路（mitophagy-animal，hsa04137）5條信號通路，利用KEGG考察了清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點參與以上信號通路的調(diào)節(jié)機制。結(jié)果表明清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點可以通過調(diào)節(jié)多條信號通路誘導腫瘤細胞發(fā)生細胞凋亡，并對肝癌細胞過度增殖、血管新生、基因組不穩(wěn)定、細胞分化阻遏及去分化狀態(tài)維持等細胞學行為進行抑制。同時對肝細胞從氧化應(yīng)激脅迫、慢性炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝癌癌前病變、早期肝癌、中期肝癌及轉(zhuǎn)移型肝癌各個階段的細胞學行為進行調(diào)節(jié)。此外，清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點可以對肝癌細胞的自噬，特別是線粒體自噬進行有效調(diào)節(jié)。

2.4 苦參堿對肝癌HepG2細胞生存率的影響

為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學實驗篩選的治療肝癌主要有效成分的可靠性，首先查閱了本課題前期初步構(gòu)建的清肝化瘀顆粒指紋圖譜[9]，并在指紋圖譜中驗證了槲皮素、木犀草素及苦參堿的存在。以上結(jié)果初步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學實驗篩選的清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要有效成分的預測結(jié)果。

苦參作為君藥在清肝化瘀顆粒組方中扮演著清熱燥濕、瀉火解毒的重要藥理學作用，在網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中發(fā)現(xiàn)苦參為清肝化瘀顆粒組方8味中藥中對應(yīng)有效成分數(shù)目及靶點數(shù)目最多的君藥，而苦參堿則是對應(yīng)靶點數(shù)目較多的有效成分之一，且在清肝化瘀顆粒組方中為苦參中獨有有效成分。既往研究也表明苦參及苦參堿在肝癌的治療中發(fā)揮重要的藥理學作用[18]。因此，推測苦參及苦參堿在清肝化瘀顆粒抗肝癌的作用機制中發(fā)揮重要作用，為了驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學實驗預測的清肝化瘀顆粒治療肝癌的主要有效成分及分子機制的可靠性，本實驗選取苦參堿作為主要有效成分代表進行了細胞模型實驗驗證。使用不同濃度的苦參堿處理HepG2細胞12 h后采用CCK-8實驗考察細胞的生存率。結(jié)果表明，5、10 nmol/L苦參堿處理后，HepG2細胞的生存率分別為對照組的81.2%、62.4%，提示與對照組相比，苦參堿可以顯著降低HepG2細胞的生存率，且存在劑量相關(guān)性。實驗結(jié)果同時表明1 nmol/L苦參堿對于HepG2細胞無細胞毒性，生存率為對照組的98.3%，與對照組相比無顯著差異?？鄥A對HepG2細胞的最小抑制濃度為5 nmol/L。因此，選擇5 nmol/L劑量的苦參堿作為肝癌細胞模型后續(xù)實驗處理濃度。

圖3 清肝化瘀顆粒治療肝癌作用靶點的GO-生物學過程分析(A)、GO-細胞組分分析(B)、GO-分子功能分析(C) 和KEGG富集分析(D)

2.5 苦參堿對肝癌HepG2細胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測苦參堿處理肝癌HepG2細胞后細胞凋亡的變化情況。結(jié)果如圖4所示，對照組HepG2細胞中細胞凋亡率為4.9%（圖4-A），5 nmol/L苦參堿處理HepG2細胞后細胞凋亡率與對照組相比顯著提高，達到20.2%（圖4-C），而細胞凋亡抑制劑z-VAD-FMK處理可以顯著抑制苦參堿誘導的HepG2細胞凋亡，凋亡率下調(diào)至6.2%（圖4-D）。以上結(jié)果表明，苦參堿可以在肝癌HepG2細胞中誘導線粒體依賴的內(nèi)源性細胞凋亡。

A-對照組 B-z-VAD-FMK組 C-苦參堿組 D-苦參堿聯(lián)合z-VAD-FMK組

2.6 苦參堿對肝癌HepG2細胞氧化應(yīng)激標志物的影響

使用苦參堿作用于肝癌HepG2細胞12 h后，利用試劑盒檢測細胞體內(nèi)的氧化應(yīng)激標志物的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為5 nmol/L的苦參堿處理后，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激標志物GSH的濃度下調(diào)至23.9 nmol/mg（以蛋白量計，下同），而對照組中GSH的濃度為51.5 nmol/mg，提示苦參堿可以顯著下調(diào)肝癌HepG2細胞中GSH濃度。此外，5 nmol/L苦參堿處理后，另一種氧化應(yīng)激標志物SOD的濃度下調(diào)至4.10 U/mg，而對照組SOD的濃度則為8.62 U/mg，提示苦參堿可以顯著下調(diào)肝癌HepG2細胞中SOD的水平。而濃度為1 nmol/L苦參堿處理的肝癌細胞中，氧化應(yīng)激標志物無顯著變化（GSH濃度為49.4 nmol/mg，SOD濃度為8.40 U/mg）。這一部分的實驗結(jié)果說明苦參堿處理后，肝癌細胞模型中出現(xiàn)氧化應(yīng)激脅迫，而苦參堿誘導的線粒體依賴性細胞凋亡可能與氧化應(yīng)激脅迫環(huán)境的出現(xiàn)有關(guān)。

2.7 苦參堿對肝癌HepG2細胞中VEGFA含量的影響

利用ELISA法檢測苦參堿處理肝癌HepG2細胞12 h后，其中VEGFA的含量變化。結(jié)果表明，與對照組相比，5 nmol/L苦參堿處理后，肝癌細胞HepG2中的VEGFA水平顯著下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)為2.4倍，而濃度為1 nmol/L苦參堿在肝癌細胞中對VEGFA水平無影響。

2.8 苦參堿對肝癌HepG2細胞中TP53及CCND1表達量的影響

利用Western blotting法檢測苦參堿處理12 h肝癌HepG2細胞中TP53及CCND1的表達量變化。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，HepG2細胞在5、10 nmol/L苦參堿處理后TP53蛋白的表達量顯著提高（＜0.05），上調(diào)倍數(shù)分別為3.4倍與3.1倍；CCND1蛋白的表達量則顯著下調(diào)（＜0.01），下調(diào)幅度分別為83.9%、83.8%。而濃度為1 nmol/L苦參堿對肝癌HepG2細胞中2種蛋白的表達量無影響。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

2.9 苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠瘤體積的影響

為了驗證細胞實驗檢測的苦參堿對肝癌細胞生物學行為的作用，本實驗探究了苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠模型的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，給藥前對照組[（129.47±8.67）mm3]與苦參堿組[（129.73±7.51）mm3]中裸鼠瘤體積無統(tǒng)計學差異。給藥后，與對照組[（2 163.58±400.40）mm3]相比，苦參堿組[（1 286.45±210.10）mm3）]裸鼠瘤體積顯著減?。ǎ?.05），抑瘤率為40.5%（圖6-A）。此外，由腫瘤瘤體生長曲線（圖6-B）可見，從14 d起，苦參堿延緩了裸鼠瘤體的生長速度。

1～5-每組中肝癌荷瘤裸鼠編號 與對照組比較：*P＜0.05

2.10 苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠瘤體病理組織學影響

為了進一步驗證苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠模型的治療作用，對肝癌荷瘤裸鼠瘤體進行了病理組織學觀察。對照組瘤體可見完整的白色包膜，瘤體存在較多的出血及壞死組織；苦參堿組瘤體體積顯著小于對照組，出血組織及壞死組織少于對照組。鏡下可見對照組肝癌組織一系列病理變化，如肝細胞索紊亂，細胞形態(tài)異常，細胞核體積變大，細胞質(zhì)內(nèi)容物增多，深核染色以及炎癥細胞浸潤等。與對照組相比，苦參堿組上述病理改變顯著減輕（圖7）。

2.11 苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠瘤體細胞凋亡的影響

為了進一步驗證苦參堿對肝癌細胞凋亡行為的調(diào)控，利用TUNEL染色法對苦參堿處理后肝癌荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)肝癌細胞的凋亡水平進行了檢測。如圖8所示，與對照組相比，苦參堿處理后肝癌荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)發(fā)生凋亡的細胞數(shù)明顯增多。

2.12 苦參堿對肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子的調(diào)節(jié)作用

以線粒體自噬及線粒體分裂為代表的線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制與在腫瘤細胞中被廣泛抑制的線粒體介導的內(nèi)源性細胞凋亡存在相互調(diào)節(jié)作用。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)苦參堿可以在HepG2細胞中通過抑制PINK1/Parkin通路相關(guān)的線粒體自噬及激活MST1/JNK通路相關(guān)的線粒體分裂誘導細胞凋亡的發(fā)生，抑制肝癌細胞增殖[19-20]。網(wǎng)絡(luò)藥理學研究結(jié)果也表明清肝化瘀顆粒及其有效成分可能通過調(diào)節(jié)肝癌細胞凋亡與細胞自噬，并通過調(diào)節(jié)線粒體細胞學行為發(fā)揮抑制肝癌的作用，因此本實驗通過免疫組化及Western blotting驗證了苦參堿給藥后肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子的表達水平變化。如圖9所示，免疫組化染色顯示對照組瘤體MST1陽性細胞率為（27.90±5.51）%，苦參堿組瘤體MST1陽性細胞率為（45.92±8.62）%，與對照組相比顯著提高（＜0.01）；此外，對照組瘤體Parkin陽性細胞率為（41.50±3.80）%，苦參堿組瘤體Parkin陽性細胞率為（33.69±2.98）%，與對照組相比顯著降低（＜0.05）。Western blotting結(jié)果驗證了免疫組化的結(jié)果，如圖10所示，苦參堿給藥后線粒體分裂相關(guān)蛋白MST1及p-JNK表達量較對照組顯著提高（＜0.01），MST1、p-JNK上調(diào)倍數(shù)分別為2.1倍和5.2倍；而線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1及Parkin在苦參堿給藥后表達水平較對照組顯著下調(diào)，PINK1下調(diào)62.9%（＜0.01），Parkin下調(diào)40.2%（＜0.05）。以上結(jié)果提示苦參堿可以在肝癌動物模型中對線粒體穩(wěn)態(tài)進行調(diào)節(jié)。

圖7 裸鼠瘤體病理切片(HE染色，×400)

圖8 TUNEL法檢測肝癌荷瘤裸鼠瘤體細胞凋亡情況(×400)

圖9 免疫組化法檢測肝癌荷瘤裸鼠瘤體線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)分子表達情況(×400)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3 討論

本研究從清肝化瘀方8味中藥中發(fā)現(xiàn)了可以作用于肝癌治療靶點蛋白的136種有效成分，其中槲皮素、木犀草素、苦參堿為對應(yīng)靶點與信號通路數(shù)量較多的有效成分，同時這幾種有效成分也為清肝化瘀顆粒組方中君藥和臣藥的主要藥效成分，且具有較好的口服利用度與成藥性，這一結(jié)果從主要成分的層次說明了清肝化瘀顆粒配伍嚴謹，君臣佐使搭配精妙，處方遣方用藥合理科學。既往研究發(fā)現(xiàn)這3種化合物具有較好的抗腫瘤活性。Salama等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過調(diào)節(jié)酪蛋白激酶2α（Casein kinase 2α，CK2α）/cyclin D1的表達量阻遏肝癌細胞的細胞周期進程，同時通過調(diào)節(jié)p53/Caspase-3信號通路解除肝癌細胞凋亡的抑制進而下調(diào)肝癌細胞的增殖水平。研究人員發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以誘導肝癌Hep3B細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與的細胞凋亡，同時抑制其細胞增殖水平[22]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)苦參堿可以通過誘導肝癌細胞凋亡與自噬的相互調(diào)節(jié)對肝癌細胞的惡性增殖進行抑制[23]。

本研究也利用體內(nèi)外實驗同時驗證了苦參堿對于肝癌細胞增殖的抑制作用。本研究同時發(fā)現(xiàn)，清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中評分較高的靶點蛋白也是槲皮素、木犀草素及苦參堿的靶點蛋白，并可以富集到多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號途徑中。因此，推測以槲皮素、木犀草素、苦參堿為代表的3種主要成分在清肝化瘀顆粒治療肝癌中發(fā)揮主導作用。這為從有效單體成分水平研究清肝化瘀顆粒治療肝癌的作用提供了依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學工具發(fā)現(xiàn)TP53、CCND1及VEGFA為清肝化瘀顆粒治療肝癌靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白。TP53是人體中最重要的抑癌蛋白，其可在多種惡性腫瘤中起到抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。P53信號通路的活性抑制可以在肝癌細胞中維持惡性增殖、凋亡抑制及侵襲轉(zhuǎn)移等多種腫瘤細胞學行為的激活，進而對肝癌的發(fā)生發(fā)展提供機會[24]。CCND1是一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可以對細胞周期蛋白依賴性激酶進行調(diào)節(jié)并參與G1期向S期的細胞周期轉(zhuǎn)化。CCND1參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明CCND1可以通過調(diào)節(jié)肝癌細胞的細胞周期進程對肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、肝癌干細胞干性維持及化療藥物耐藥性形成等腫瘤細胞學行為發(fā)揮促進作用[25]。VEGFA為生長因子家族的成員，其在許多腫瘤組織中表達量上調(diào)并與腫瘤分期及進展相關(guān)，既往研究表明，其在肝癌中可以在氧化應(yīng)激脅迫下誘導促癌炎癥微環(huán)境形成，促進肝癌細胞的血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移與免疫逃逸，同時抑制肝癌細胞凋亡進而引起肝癌細胞惡性增殖[26]。本研究利用基因功能富集分析結(jié)果顯示，TP53、CCND1及VEGFA可以參與細胞凋亡通路、氧化應(yīng)激脅迫相關(guān)信號通路、細胞增殖相關(guān)信號通路及細胞周期相關(guān)信號通路多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學工具同時發(fā)現(xiàn)，來自清肝化瘀顆粒組方中藥的多種有效成分可與這3種靶點發(fā)生相互作用，進一步的體外實驗也證實苦參堿對這3種靶點蛋白的調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果說明TP53、CCND1及VEGFA可以作為核心靶點在清肝化瘀顆粒對肝癌的治療中發(fā)揮著重要作用，為從靶點水平上闡釋清肝化瘀顆粒治療肝癌的分子學機制提供了依據(jù)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種蛋白分子、多條信號通路對多種細胞生物學行為進行調(diào)節(jié)的結(jié)果。而中醫(yī)藥對疾病多靶點、多信號通路，整體性的治療方式在腫瘤的治療中具有極大優(yōu)勢。本研究對獲得的清肝化瘀顆粒治療肝癌的靶點基因進行富集分析發(fā)現(xiàn)其治療肝癌的靶點蛋白可以富集到包括磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase-Akt，PI3K-Akt）信號通路，P53信號通路及JAK激酶-信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號通路等與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，基因富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些靶點基因可以定位于肝癌細胞的各個組分，并在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中對促炎微環(huán)境形成、氧化應(yīng)激脅迫、代謝重編程、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡進程以及侵襲轉(zhuǎn)移等肝癌細胞生物學調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮重要作用。線粒體作為整合細胞能量代謝、物質(zhì)代謝和生命信號轉(zhuǎn)導的細胞器，在細胞的環(huán)境適應(yīng)與存活作用中不可或缺[27]。因此，線粒體的功能與自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物治療腫瘤的效果至關(guān)重要，線粒體的生物發(fā)生、裂變與融合、新陳代謝與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)，線粒體自噬及線粒體參與的細胞凋亡等生物學事件都在腫瘤細胞的存活與死亡中扮演重要角色，其在腫瘤靶向治療中也發(fā)揮著重要作用[28]。本研究利用苦參堿治療HepG2肝癌荷瘤裸鼠后發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以在肝癌細胞中通過PINK1/Parkin信號通路與MST1-JNK信號途徑對線粒體自穩(wěn)態(tài)進行調(diào)節(jié)，并重新激活被抑制的細胞凋亡進程，進而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。同時在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以誘導肝癌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激脅迫及細胞凋亡進程。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)清肝化瘀方含藥血清對肝癌細胞的抑制與線粒體參與的代謝重編程、細胞凋亡及細胞增殖等肝癌細胞生物學行為的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[29]。以上研究結(jié)果進一步說明清肝化瘀顆粒組方可以通過多成分、多靶點、多信號通路對肝癌的多種生物學行為進行抑制，苦參堿在其中可以作為主要有效成分發(fā)揮作用，此外作為細胞生命活動，新陳代謝途徑及信號通路的交匯中心，線粒體在清肝化瘀顆粒抑制肝癌的作用中發(fā)揮著重要作用。

肝癌在中醫(yī)屬“肝積”“癥積”“鼓脹”“脅痛”等范疇，中醫(yī)學認為，由于機體正氣虛弱，外感邪毒；或情志抑郁，氣滯血瘀；或脾失健運，濕濁內(nèi)生，終致濕濁瘀毒結(jié)于臟腑所致。根據(jù)我國衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》及國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《肝癌中醫(yī)診療方案》，肝癌從發(fā)病到進展等各個時期的臨床表現(xiàn)可辨證分型為“肝膽濕熱證”及“肝熱血瘀證”等5種[6]。針對肝癌的這些辨證分型也符合現(xiàn)代人因過度進食高蛋白、高脂肪的飲食，進而影響脾胃運化，積聚而生濕濁的肝癌病因[7]；也符合惡性腫瘤患者氣血不足甚至氣血衰敗，癥積日久進而瘀阻血脈造成的氣血運行不暢等臨床表現(xiàn)[8]。研究表明，濕熱證可通過調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)，影響代謝及腸道微環(huán)境誘導腫瘤的發(fā)生發(fā)展，清熱燥濕類中藥可發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群、調(diào)節(jié)血糖血脂等作用。清肝化瘀顆粒是由苦參、黃芩等8味中藥組成，具有清熱解毒、化瘀散結(jié)、健脾益氣之功。其中苦參、黃芩作為君藥，可清熱燥濕、瀉火解毒；白術(shù)、莪術(shù)作為臣藥，可健脾和胃、活血化瘀；臣藥之中另外2味為半枝蓮及白花蛇舌草，有加強清熱解毒及抗癌作用，輔以消腫散結(jié)的功效；三棱為佐藥，可以增強活血化瘀、軟堅消癥的藥效；使藥為甘草，有解毒扶正、益氣且調(diào)和諸藥的作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學發(fā)現(xiàn)清肝化瘀顆粒組方中藥可對細胞凋亡、代謝重編程、促癌炎癥微環(huán)境、血管新生與侵襲轉(zhuǎn)移等多種肝癌細胞學行為發(fā)揮作用。而改善炎癥微環(huán)境、降低氧化應(yīng)激脅迫、調(diào)節(jié)細胞凋亡及阻止血管新生可能是清肝化瘀顆粒發(fā)揮清熱解毒、破瘀散結(jié)功效的主要分子機制。既往研究也發(fā)現(xiàn)，清肝化瘀方可以通過改變VEGFA信號通路，抑制肝癌模型大鼠的血管新生和侵襲轉(zhuǎn)移，同時通過促進肝癌細胞凋亡發(fā)揮肝癌抑制作用[30]，基于清肝化瘀方聯(lián)合肝動脈化療栓塞的肝癌臨床研究也得到了類似的結(jié)論[31]?；谝陨蟼鹘y(tǒng)醫(yī)學和現(xiàn)代醫(yī)學2個角度的研究結(jié)果，推測清肝化瘀顆?？梢酝ㄟ^組方中藥中的多種有效成分，對多靶點、多通路、多生物學行為進行調(diào)節(jié)，同時對現(xiàn)代人群中濕熱型肝癌發(fā)揮治療作用，而改善炎癥微環(huán)境、降低氧化應(yīng)激脅迫、調(diào)節(jié)細胞凋亡及阻止血管新生可能是清肝化瘀顆粒發(fā)揮清熱解毒、破瘀散結(jié)功效的主要分子機制。

本研究為中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌的作用機制研究提供了理論依據(jù)及新思路，也為傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的現(xiàn)代化奠定了基礎(chǔ)。為進一步驗證本研究所得出的結(jié)果，利用分子細胞生物學及動物實驗研究，對本研究預測的有效成分、靶點蛋白、信號通路及細胞生物學行為開展深入研究，以期為祖國醫(yī)學在肝癌治療中的應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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An exploration on mechanisms of Qinggan Huayu Granule in treating liver cancer based on network pharmacology

CAO Jian1, ZHU Xiao-ran2, YANG Zhen-huan2, SUO Fei-ya2, YAO Shu-kun1, 2, 3

1. School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, Beijing 100191, China 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Department of Gastroenterology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

To investigate the main active compounds, molecular target genes, and target signal pathways of Qinggan Huayu Granule (清肝化瘀顆粒) treating liver cancer.Based on multiple traditional Chinese medicine and disease databases, the network pharmacology tool was used to screen the main active compounds and action targets of Qinggan Huayu Granule treating liver cancer, analyze the biological functions of potential targets, and construct a network of “herb-ingredient-target-disease”. Theandexperiment was used to verify the effect of matrine, the core component of Qinggan Huayu Granule, on cytological behaviors of liver cancer cells. The regulation of matrine on the candidate target protein was also detected.A total of 86 potential targets for the treatment of liver cancer were screened by traditional Chinese medicine and disease databases. Through enrichment analysis of potential targets, there were 20 biological processes, 15 cellular components, 20 molecular functions, and 20 signaling pathways were yielded. Using “herb-ingredient-target-disease” network, it was found that Qinggan Huayu Granule regulated the biological behaviors of tumors related to liver cancer, such as apoptosis and autophagy, by mainly targets tumor protein p53 (TP53), vascular endothelial growth factor A (VEGFA), G1/S-specific cyclin-D1(CCND1), and other hub genes through quercetin, luteolin, matrine and other active ingredients.experiments revealed that matrine could inhibit cell proliferation, promote apoptosis, and modulate the levels of molecular markers of oxidative stress in a dose-dependent manner in liver cancer cell model. At the same time, matrine can regulate expression of TP53, VEGFA, and CCND1 in protein level.experiments showed that matrine had a tumor suppression effect on HepG2 xenograft tumors in nude mice, and induced apoptosis of liver cancer cells. Meanwhile, matrine regulated the expression in protein levels of mitophagy and mitochondrial fission related molecules.The main mechanism of Qinggan Huayu Granule in treating liver cancer was related to systematic synergy effect of multiple compounds as represented by quercetin, luteolin and matrine, multiple targets as represented by TP53, VEGFA and CCND1, multiple signal pathways as presented by the regulation effects of apoptosis, mitochondrial homeostasis and oxidative stress.

network pharmacology; Qinggan Huayu Granule; liver cancer; matrine; molecular mechanism; quercetin; luteolin

R285

A

0253 - 2670(2021)07 - 2039 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.021

2020-08-13

北京市科委G20工程創(chuàng)新研究十病十藥研發(fā)項目（Z171100001717008）

曹 建（1990—），男，博士研究生，主要研究方向為中藥單體抗腫瘤機制。Tel: (010)84206160 E-mail: caojian120@163.com

姚樹坤，博士生導師，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合抗肝癌的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: shukun_yao@163.com

[責任編輯 潘明佳]