miR?488?3p在子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移中的作用研究

吳琪瑞 王艷華 劉林英 高麗娜 殷荷 張玉月 韓可棟 張慧萍，4，5

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2總醫(yī)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川750004）；4國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種多系統(tǒng)受累的妊娠特異性綜合征，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦發(fā)病和死亡的主要原因之一［1］。研究發(fā)現(xiàn)，PE 會(huì)增加孕婦發(fā)生肺水腫、羊水栓塞、急性腎功能衰竭和死亡的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，也會(huì)增加新生兒不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)，如早產(chǎn)、流產(chǎn)、呼吸窘迫綜合征和死亡等，嚴(yán)重威脅母嬰健康［2-3］。然而，PE 的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，亟待進(jìn)一步研究。MicroRNA（miRNA）是一種長度約為22 個(gè)核苷酸的小的單鏈非編碼RNA，參與調(diào)節(jié)人類細(xì)胞中約三分之一的蛋白質(zhì)編碼基因，通過抑制mRNA 翻譯和降低mRNA 穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等一系列生命活動(dòng)［4-5］。有文獻(xiàn)報(bào)道［6-7］，與正常孕婦相比，PE 患者胎盤和血清中的某些miRNA 存在差異表達(dá)，提示miRNA 可能參與了PE 的發(fā)生發(fā)展。其中，miR?488?3p 已被證實(shí)在多種癌癥中是一種腫瘤抑制因子，但其在PE 中的作用尚不清楚。故本研究探討miR?488?3p 在人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移中的作用，并進(jìn)一步探討其在PE 中的臨床價(jià)值，為PE 的診斷及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2018年2月寧夏國龍婦產(chǎn)醫(yī)院收治的PE 患者30 例和同期健康妊娠分娩的正常孕婦（normal pregnancy，NP）30 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：妊娠20 周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg，同時(shí)伴有蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h 或隨機(jī)尿蛋白≥+），且無消耗性疾病。組織標(biāo)本收集前征得所有孕產(chǎn)婦同意并簽署知情同意書，組織收集后均凍存于-80 ℃冰箱。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。NP和PE 組臨床資料比較，除孕婦年齡和孕周外，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 NP 和PE 組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between NP and PE groups x±s

1.2 主要試劑人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR?8/SV?neo）購于上海復(fù)旦細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI?1640培養(yǎng)基（美國，Gibco）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（北京，索萊寶）；總RNA 提取試劑盒（北京，天根）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本，Taka?ra）；Matrigel 基質(zhì)膠（美國，BD）；Transwell 小室（美國，Corning）；miR?488?3p mimic 及NC 和miR?488?3p inhibitor 及NC（上海，吉瑪）；miR?488?3p 和U6引物由廣州銳博公司合成，MMP2 和GAPDH 引物由上海生工公司合成，序列見表2。

表2 MMP2 和GAPDH 引物序列Tab.2 MMP2 and GAPDH primer sequences

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，使用含有7%胎牛血清、100 μg/mL 青鏈霉素的RPMI?1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞，細(xì)胞長至90%融合度時(shí)用胰蛋白酶進(jìn)行傳代，每1 ～2 d換一次培養(yǎng)液。同時(shí)，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長至60%～70%融合度時(shí)添加轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞分5 組：con?trol、miR?488?3p NC、miR?488?3p mimic、inhibitor NC 和miR?488?3p inhibitor，培養(yǎng)4?6 h 后棄原培養(yǎng)基，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞重懸，計(jì)數(shù)，按1 × 105細(xì)胞/孔接種于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含有15%血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，用棉簽擦去上室未遷移的細(xì)胞，晾干，100 倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照，每個(gè)小室隨機(jī)取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提前將Matrigel 基質(zhì)膠從-20 ℃取出放在4 ℃過夜使其融化，次日在冰上按照1∶8 的比例用無血清RPMI?1640 稀釋并混勻，加入Transwell 小室100 μL，搖勻，放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜使膠凝固。余步驟與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.6 Real?time PCR 檢測(cè)分別按照總RNA 提取試劑盒說明書提取胎盤組織和滋養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，樣本OD260/280 控制在1.8 ～2.0，然后按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并置于熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，總體系為20 μL。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果以表示，用Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。兩組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，多組間兩兩比較采用單因素方差分析，miR?488?3p 與PE 臨床特征的關(guān)系采用pearson 相關(guān)性分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?488?3p 在PE 胎盤組織中的表達(dá)水平qRT?PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與NP 組比較，PE 組miR?488?3p 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），提示miR?488?3p 在PE 患者胎盤組織中高表達(dá)，其可能參與PE 的發(fā)生發(fā)展，見圖1。

2.2 miR?488?3p 的表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性分析如圖2，miR?488?3p 的表達(dá)水平與收縮壓（r= 0.377 2，P= 0.003 0）、舒張壓（r= 0.323 8，P=0.011 6）均有顯著正相關(guān)性，進(jìn)一步提示miR?488?3p 與PE 密切相關(guān)，且miR?488?3p 的表達(dá)水平可能與PE 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

圖1 miR?488?3p 在NP 和PE 胎盤組織中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of miR?488?3p in placenta of NP and PE

圖2 胎盤組織中miR?488?3p 的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Fig.2 Relationship between expression of miR?488?3p and clinical features in placenta

2.3 miR?488?3p 對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響如圖3，mimic 組中miR?488?3p 表達(dá)高于mimic?NC組（P＜0.001），而inhibitor 組中的miR?488?3p 表達(dá)低于inhibitor?NC 組（P＜0.05），提示過表達(dá)miR?488?3p 及抑制miR?488?3p 細(xì)胞構(gòu)建成功。Tran?swell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與mimic?NC 組比較，mimic 組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；相反，與inhibitor?NC 組比較，inhibitor 組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01），提示過表達(dá)miR?488?3p 可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力，而抑制miR?488?3p 后則相反，見圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染miR?488?3p mimic 和inhibitor 后miR?488?3p 的表達(dá)Fig.3 Expression of miR?488?3p after transfection of miR?488?3p mimic and inhibitor

圖4 miR?488?3p 對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miR?488?3p on trophoblast cells invasion

2.4 miR?488?3p 對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力的影響如圖5，轉(zhuǎn)染mimic 和inhibitor 后，滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力的變化與侵襲能力呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，提示過表達(dá)miR?488?3p 可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移能力，而抑制miR?488?3p 后則相反。

2.5 生物信息軟件預(yù)測(cè)MMP2 是miR?488?3p 可能作用的靶基因軟件分析發(fā)現(xiàn)，MMP2 mRNA 3′UTR 與miR?488?3p 有結(jié)合位點(diǎn)，提示MMP2 可能是miR?488?3p 的下游靶基因，見圖6。

圖5 miR?488?3p 對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移的影響Fig.5 Effect of miR?488?3p on trophoblast cells migration

圖6 miR?488?3p 與MMP2 的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Predicted binding sites of miR?488?3p and MMP2

2.6 MMP2 mRNA在PE胎盤組織中的表達(dá)qRT?PCR 檢測(cè)MMP2 在 上 述30 例PE 組 及30 例NP 組胎盤組織中的表達(dá)，結(jié)果如圖7，PE 組中MMP2 含量低于NP 組（P＜0.05）。MMP2 在胎盤組織中的表達(dá)水平與miR?488?3p 相反，提示miR?488?3p 可能對(duì)MMP2 有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

圖7 MMP2 在NP 和PE 胎盤組織中的表達(dá)水平Fig.7 Expression of MMP2 in placental tissues of NP and PE

2.7 miR?488?3p對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP2表達(dá)的影響同時(shí)，qRT?PCR 結(jié)果顯示，與NC 組比較，過表達(dá)miR?488?3p 明顯抑制MMP2 的表達(dá)（P＜0.001）；相反，miR?488?3p 表達(dá)下調(diào)增加MMP2 的表達(dá)（P＜0.05），提示miR?488?3p 可能通過抑制MMP2的表達(dá)調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移，見圖8。

圖8 miR?488?3p 對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞中MMP2 表達(dá)的影響Fig.8 Effect of miR?488?3p on the expression of MMP2 in trophoblast cells

3 討論

PE 是一種以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的妊娠并發(fā)癥，它影響全世界2%至8%的孕婦，是孕產(chǎn)婦和新生兒死亡的主要原因［8］。目前臨床上，分娩是唯一已知的治愈方法，而其它治療手段只是起到控制病情和延緩孕周的目的［9］。近些年，隨著分子生物學(xué)和非編碼RNA的發(fā)展，miRNA的分子靶向精準(zhǔn)治療為臨床PE治療提供了新的思路。

越來越多的數(shù)據(jù)證明，miRNA能夠參與調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、遷移、侵襲、增殖、凋亡、血管生成和細(xì)胞代謝等多種生物學(xué)過程［10-12］。其中，miR?488?3p已被證實(shí)在食管鱗癌、小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤組織中低表達(dá)，其作為一種腫瘤抑制因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13-14］。同時(shí)，在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等非腫瘤性疾病中miR?488?3p 也發(fā)揮著重要作用［15］。但關(guān)于miR?488?3p 在PE 中的表達(dá)及作用機(jī)制尚未見研究。本研究發(fā)現(xiàn)，miR?488?3p 在PE 胎盤組織中呈高表達(dá)，同時(shí)miR?488?3p 的表達(dá)水平與PE收縮壓、舒張壓正相關(guān)，提示miR?488?3p 的高表達(dá)與PE 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并可能隨著PE 病情加重表達(dá)增加，同時(shí)，miR?488?3p 也可能成為PE治療的靶點(diǎn)及早期診斷的分子標(biāo)記物。

臨床和病理研究表明胎盤在PE 的發(fā)病機(jī)制中處于中心地位；而滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤的主要成分，其浸潤不足是PE 最突出的病理特征，也是PE 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［16-17］。滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移特性與腫瘤細(xì)胞相似，但不同的是滋養(yǎng)層細(xì)胞具有嚴(yán)格的時(shí)空限制和精細(xì)調(diào)控，同時(shí)僅限于子宮的早期妊娠［18］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)miR?488?3p 抑制表達(dá)后，滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)，相反，miR?488?3p 進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)后滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著減弱。

miRNA 通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與多種生理過程［5］。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MMP2 3′UTR 區(qū)與miR?488?3p 存在可結(jié)合的位點(diǎn)，推測(cè)MMP2 可能是miR?488?3p 的下游靶基因。MMP2 是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中的一員，能特異性降解Ⅳ型膠原酶等多種細(xì)胞外基質(zhì)，從而為細(xì)胞的侵襲遷移提供有利條件。研究表明，在妊娠早期，MMP2 的減少干擾了妊娠早期螺旋動(dòng)脈的正常重構(gòu)，導(dǎo)致了PE 最初的病理生理變化［19］。本研究結(jié)果顯示MMP2 在PE 胎盤組織中的含量低于NP 組，與miR?488?3p 的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)；同時(shí)，滋養(yǎng)層細(xì)胞中過表達(dá)miR?488?3p 能夠下調(diào)MMP2 的表達(dá)，而抑制miR?488?3p 則增加MMP2的表達(dá)，以上結(jié)果表明miR?488?3p 可能通過調(diào)控MMP2 調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR?488?3p 在PE 胎盤組織中高表達(dá)，且表達(dá)水平與PE 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；而抑制miR?488?3p 的表達(dá)水平能夠顯著增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能與miR?488?3p 負(fù)向調(diào)控MMP2 有關(guān)。這將為PE 的發(fā)病機(jī)制開拓一個(gè)新的方向，同時(shí)，由于miRNA 本身的保守性，后續(xù)可以在PE 動(dòng)物模型上敲除miR?488?3p，進(jìn)一步探索其功能及作用機(jī)制，為PE 分子靶向精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)。