汪斌偉，柯 莎，李 珣，袁盛勇，孔 瓊，王傳銘，張曉媛，李秀芳，楊華芳

（紅河學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661199）

氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）是一種存在于昆蟲化學(xué)感受器官的水溶性酸性蛋白，是氣味分子和受體間的橋梁，在信息素識(shí)別、嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)及運(yùn)輸?shù)染哂兄匾饔茫瑥亩绊懼ハx取食（雌雄蟲的趨性行為）、繁殖（配偶探求、交配和產(chǎn)卵）和天敵躲避等生理行為反應(yīng)。[1-3]由于OBPs對氣味分子選擇具有相對專一性，且每一種OBP只能結(jié)合某一類別的氣味分子，是昆蟲嗅覺識(shí)別過程中的關(guān)鍵步驟。[4]而分子對接是研究小分子配體與大分子受體間相互作用的一種方法，可預(yù)測二者間的親和力、結(jié)合模式和結(jié)合情況，從而篩選出與大分子受體結(jié)合能力較強(qiáng)的小分子配體。[5]該技術(shù)已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如生物大分子的修飾、藥物設(shè)計(jì)、昆蟲嗅覺機(jī)制等方面。[6-8]

南瓜實(shí)蠅Bactrocera tau(Walker)是一種重要的檢疫性害蟲，分布于我國的東南沿海、華中、華南、西南等地區(qū)，其寄主廣泛，危害嚴(yán)重。[9]目前該害蟲防治仍靠化學(xué)方法，且根據(jù)昆蟲寄主揮發(fā)物篩選出的干擾劑在害蟲防治上也得到了廣泛應(yīng)用。本文通過同源建模預(yù)測南瓜實(shí)蠅OBPs的三維結(jié)構(gòu)，運(yùn)用分子對接技術(shù)對南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9的三維結(jié)構(gòu)與4種小分子配體（十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯）之間的相互作用和結(jié)合能力進(jìn)行分析，為了解南瓜實(shí)蠅OBPs與揮發(fā)性氣味分子之間的作用機(jī)制，并篩選出結(jié)合力較強(qiáng)的揮發(fā)物，為南瓜實(shí)蠅的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

利用本課題組的前期研究結(jié)果克隆鑒定出的南瓜實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白基因OBP2、OBP8、OBP9的序列（GenBank登錄號(hào)分別為：KT716322.1、KT716317.1、KT716318.1）和4種小分子配體（十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯）的三維模型為試驗(yàn)材料；同源建模采用SWISS-MODEL在線服務(wù)程序構(gòu)建，ChemBio3D軟件進(jìn)行優(yōu)化；分子對接采用SYBYL軟件等。

1.2 方法

1.2.1 南瓜實(shí)蠅OBPs三維模型構(gòu)建及配體分子三維結(jié)構(gòu)的優(yōu)化

通過ExPASy平臺(tái)中的SWISS-MODEL程序在線搜索與南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9相似度較高的模板，將南瓜實(shí)蠅OBPs序列與模板蛋白序列比對，選擇同源性較高的模板進(jìn)行三維建模，再對其三維模型進(jìn)行去除H2O、加H和添加缺失原子等優(yōu)化處理。[10]同時(shí)通過Pubchem在線數(shù)據(jù)下載十七烷、十八烯、D-香茅醇和D-檸檬烯這4種揮發(fā)性物質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用ChemBio3D對十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯進(jìn)行立體空間結(jié)構(gòu)構(gòu)建和最小能量優(yōu)化。[11]

1.2.2 分子對接

本文采用柔性方式進(jìn)行分子對接，即用SYBYL軟件對南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9和十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯分別進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)對接，通過Surflex-docking模塊，使用原型分子(protomol) 為結(jié)合口袋，根據(jù)參數(shù)Threshold值和Bloat值確定其結(jié)合口袋形狀及大小，找到南瓜實(shí)蠅OBPs與配體分子的最優(yōu)構(gòu)想和結(jié)合模式進(jìn)行對接，得到打分函數(shù)。[12]

2 結(jié)果與分析

2.1 同源建模

2.1.1 南瓜實(shí)蠅3個(gè)OBP的三維模型

基于氨基酸序列和結(jié)構(gòu)一致性的同源檢索，發(fā)現(xiàn)南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9三者的匹配度分別為30.97%、30.09%和46.28%，相似性均大于30%，可用于下一步試驗(yàn).經(jīng)構(gòu)建空間構(gòu)像模型發(fā)現(xiàn)，OBP2、OBP8和OBP9三維模型分別有91.94%、92.92%和95.12%的氨基酸殘基處于最佳區(qū)域，且最佳區(qū)域均大于90%，說明南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9三個(gè)蛋白的模型比較合理，在空間上也具有傳統(tǒng)的6個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，符合OBPs的保守結(jié)構(gòu)特征，并對其進(jìn)行優(yōu)化處理得到3個(gè)南瓜實(shí)蠅OBPs的三維模型，具體見圖1，保存用于分子對接。

圖1 南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.1.2 配體分子的三維結(jié)構(gòu)下載及優(yōu)化

通過查詢十七烷、十八烯、D-香茅醇和D-檸檬烯4種小分子配體的CAS號(hào)，使用Pubchem數(shù)據(jù)庫下載其三維結(jié)構(gòu)（見表 1），運(yùn)用ChemBio3D對十七烷、十八烯、D-香茅醇、D-檸檬烯進(jìn)行立體空間結(jié)構(gòu)構(gòu)建和最小能量優(yōu)化，4種小分子配體的三維結(jié)構(gòu)具體見圖 2。

表1 4種小分子配體的相關(guān)信息

圖2 4種小分子配體的三維結(jié)構(gòu)

2.2 分子對接

2.2.1 南瓜實(shí)蠅OBP2分子對接

南瓜實(shí)蠅OBP2的空間對接結(jié)構(gòu)（圖 3）與4種小分子配體對接效果如圖 4-A、B、C、D，當(dāng)CSCORE值≥4時(shí)，crash越接近于0，polar越大，說明對接結(jié)果與實(shí)驗(yàn)相似度較高，對接結(jié)果較好，反之對接結(jié)果不可靠。由表2可知，OBP2與D-香茅醇對接CSCORE值為4，綜合打分函數(shù)為4.2322，OBP2與D-檸檬烯對接CSCORE值為4，綜合打分函數(shù)為3.1346，對接結(jié)果有效，且結(jié)合模式較優(yōu)；但OBP2與十七烷和十八烯的CSCORE對接值僅為1，打分函數(shù)分別為4.0986、3.6238，對接結(jié)果不可靠.綜上表明D-香茅醇、D-檸檬烯可與南瓜實(shí)蠅OBP2相結(jié)合，但D-香茅醇的結(jié)合作用優(yōu)于D-檸檬烯（因?yàn)镈-香茅醇的polar值高于D-檸檬烯的polar值），因此這2種小分子物質(zhì)可作為該昆蟲的行為干擾劑。

表2 南瓜實(shí)蠅OBP2與4種小分子配體的對接情況

圖3 南瓜實(shí)蠅OBP2 空間結(jié)構(gòu)

圖4 南瓜實(shí)蠅OBP2與4種小分子配體的對接圖

2.2.2 南瓜實(shí)蠅OBP8分子對接

通過分子對接發(fā)現(xiàn)南瓜實(shí)蠅OBP8的空間結(jié)構(gòu)（圖5）可與4種小分子配體進(jìn)行對接（對接效果如圖6-A、B、C、D），發(fā)現(xiàn)OBP8與D-香茅醇和十七烷的對接CSCORE值為4，且綜合打分函數(shù)均高于4，因此對接結(jié)果有效，結(jié)合模式較優(yōu).而OBP8與D-檸檬烯和十八烯的對接CSCORE值分別為3和1，均低于4，綜合打分函數(shù)也低于4，對接結(jié)果不可靠（表3）。綜上表明D-香茅醇、十七烷能與南瓜實(shí)蠅OBP8相互作用，但D-香茅醇的作用優(yōu)于十七烷（因?yàn)镈-香茅醇的polar值高于十七烷的polar值，crash值更接近于0），因此這2種小分子配體可作為該昆蟲的行為干擾劑使用。

表3 南瓜實(shí)蠅OBP8與4種小分子配體的對接情況

圖5 南瓜實(shí)蠅OBP8空間結(jié)構(gòu)

圖6 南瓜實(shí)蠅OBP8與4種小分子配體的對接圖

2.2.3 南瓜實(shí)蠅OBP9分子對接

南瓜實(shí)蠅OBP9的三維模型空間對接結(jié)構(gòu)如圖7，其與4種小分子配體的對接效果如圖8-A、B、C、D。由表4可知，OBP9與D-香茅醇、十七烷的對接CSCORE值均為4，綜合打分函數(shù)均高于4，對接結(jié)果有效，且結(jié)合模式較優(yōu)；且由于D-香茅醇的polar值較大，crash值更接近于0，因此D-香茅醇與OBP9的結(jié)合作用更為緊密，表明這2種小分子配體都可以作為該昆蟲的行為干擾劑.而OBP9與D-檸檬烯和十八烯的對接CSCORE值較低，對接結(jié)果不可靠，相互間作用較小。

表4 OBP9與4種小分子配體的對接情況

圖7 南瓜實(shí)蠅OBP9空間結(jié)構(gòu)

圖8 南瓜實(shí)蠅OBP9 與4 種小分子配體的對接圖

3 小結(jié)與討論

在已知OBPs序列的昆蟲中，利用NCBI尋找近源種的OBPs基因序列，通過同源建模和分子對接后，可初步篩選得到與之結(jié)合的小分子配體物質(zhì)和探尋該類蛋白的結(jié)合特性等內(nèi)容，該方法已被應(yīng)用于茶尺蠖（Ectropis obliqua）、紫榆葉甲（Ambrostoma quadriimpressum）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）等昆蟲OBPs的結(jié)合特性研究中。[7，8，13]一般情況下，同源性大于30%時(shí)所得到的模型就是可靠的三維模型。[14]而本實(shí)驗(yàn)對南瓜實(shí)蠅OBP2、OBP8、OBP9的同源建模后的同源性均大于30%，可以開展分子對接實(shí)驗(yàn)。

氣味結(jié)合蛋白（OBPs）是昆蟲識(shí)別外界氣味物質(zhì)的特異性蛋白，大量研究發(fā)現(xiàn)昆蟲對氣味的趨向行為與OBPs有關(guān)，不同昆蟲的OBPs能與不同揮發(fā)物質(zhì)結(jié)合，且具有不同的生理功能。[15-17]不同種類的昆蟲其OBPs與之對接的配體不同，且這些配體物質(zhì)的作用也不盡相同.如蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cunea）OBP1能與γ-丁內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二甲酯和萘結(jié)合，這3種寄主揮發(fā)物對該蟲有明顯的趨避作用。[14，18]而斑翅果蠅（Drosophila suzukii）OBP56h 能與β-環(huán)檸檬醛（該物質(zhì)是草莓葉片產(chǎn)生的一種揮發(fā)性氣味物質(zhì)）結(jié)合，且對該蟲具有吸引作用，同時(shí)該蛋白與苦味化合物中的鹽酸小蘗堿及香豆素的結(jié)合親和性較強(qiáng)，但不能與苯甲地那銨、N-苯基硫脲結(jié)合。[19-20]本文研究發(fā)現(xiàn)，南瓜實(shí)蠅OBP2與D-香茅醇、D-檸檬烯結(jié)合較好，OBP8與D-香茅醇、十七烷結(jié)合效果較好，而OBP9與D-香茅醇、十七烷對接效果較好，因此十七烷、D-香茅醇和D-檸檬烯可作為南瓜實(shí)蠅田間防治中的昆蟲行為干擾劑使用，但具體干擾作用是引誘還是趨避還需進(jìn)一步研究。