王運(yùn)昌，李榮榮，蔡祎，邵長(zhǎng)亮，趙慧然，魏子依，王莉菲

（河北省眼科醫(yī)院，河北省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省眼病治療中心，邢臺(tái) 054001）

先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness, CSNB)是在臨床表現(xiàn)及遺傳方式均出現(xiàn)異質(zhì)性的一組視網(wǎng)膜異常，由光感受器啟動(dòng)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)及其與雙極細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)蛋白基因突變所致［1］。迄今為止，與CSNB相關(guān)的突變基因超過(guò)了300個(gè)［2］，比如夜盲蛋白（nyctalopin, NXY）基因NYX、代謝性谷氨酸受體6 （metabotropic glutamate receptor 6, mGluR6/ GRM6）基因GRM6，瞬時(shí)受體電位美拉他汀1 （transient receptor potential melastatin 1, TRPM1）基因TRPM1和G蛋白受體179（G protein receptor 179, GPR179）基因GPR179突變，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)蛋白無(wú)法定位于ON-雙極細(xì)胞（ON-BCs）樹(shù)突，表現(xiàn)為cCSNB；鈣離子通道α1F亞基（calcium channelα 1F subunit CACNA1F）基因CACNA1F、鈣離子結(jié)合蛋白4（Ca2+-binding protein 4, CABP4）基因CABP4和鈣離子通道α2δ4亞基（calcium channel subunit α2δ4, CACNA2D4）基因CACNA2D4突變，導(dǎo)致光感受器與雙極細(xì)胞突觸間隙谷氨酸鹽不能持續(xù)釋放，表現(xiàn)icCSNB。在視網(wǎng)膜的外叢狀層，光感受器細(xì)胞與雙極細(xì)胞形成突觸，在突觸后表面由亮氨酸富集重復(fù)序列免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白3 （leucine-rich repeat，immunoglobulin-like and transmembrane domains protein 3, LRIT3）、NXY、mGluR6、GPR179和TRPM1組成信號(hào)通路復(fù)合體，對(duì)ON-雙極細(xì)胞去極化起到關(guān)鍵作用；突變的LRIT3與NYX、GRM6、TRPM1和GPR179均可使突觸后信號(hào)復(fù)合體功能障礙，表現(xiàn)為b波嚴(yán)重下降或缺失。LRIT3突變病人ON-雙極細(xì)胞功能異常而OFF-雙極細(xì)胞功能未受影響，提示LRIT3在錐細(xì)胞與ON-雙極細(xì)胞突觸的形成及其功能上有選擇性作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于LRIT3突變方式及其突變后表達(dá)的障礙，LRIT3蛋白特異性結(jié)構(gòu)對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用有了比較深入的研究。本文將從人及動(dòng)物模型LRIT3突變的研究現(xiàn)狀、LRIT3蛋白結(jié)構(gòu)及突觸后信號(hào)復(fù)合體研究現(xiàn)狀、LRIT3蛋白在錐細(xì)胞-ON-BCs突觸形成及信號(hào)傳導(dǎo)的特異性作用這三方面來(lái)闡述。

1 人及動(dòng)物模型LRIT3突變的研究現(xiàn)狀

1.1 人LRIT3突變的研究現(xiàn)狀

目前關(guān)于LRIT3表達(dá)、定位及功能的研究很有限，運(yùn)用基因表達(dá)序列標(biāo)簽法可測(cè)得LRIT3在中樞神經(jīng)和視網(wǎng)膜表達(dá)，LRIT3位于染色體4q25包括4個(gè)外顯子1區(qū)域［7］。目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)于人LRIT3突變位點(diǎn)的研究依舊很局限。

Zeitz et al率先利用外顯子測(cè)序法對(duì)cCSNB的DNA樣本測(cè)定，確定了LRIT3兩個(gè)復(fù)合雜合子突變［2］，分別為位于外顯子4的c.[1151C>G];[1538_1539del](p.[Ser384*];[Ser-513Cysfs*59])和c.[983G>A]; [1318C>T] (p.[Cys328Tyr]; [Arg440*])。p.[Ser384*]、p. [Arg440*]、p. [Ser513Cysfs*59]產(chǎn)生的蛋白均缺少跨膜結(jié)構(gòu)域和PDZ-結(jié)合模序（PSD95, DLG1andZO1-binding motifs），無(wú)法與LRIT3蛋白一同形成支架，因而位于細(xì)胞質(zhì)的TRPM1不能被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面［4］，在光刺激下，錐、桿細(xì)胞末端釋放谷氨酸鹽減少，ON-BCs樹(shù)突的mGluR6處于非結(jié)合狀態(tài)，G蛋白失活，離子通道TRPM1開(kāi)放，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，ONBCs去極化產(chǎn)生b波，TRPM1在ON-BCs表面的表達(dá)障礙會(huì)出現(xiàn)ERG b波缺失，臨床上會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定無(wú)進(jìn)展的夜盲癥狀；p.[Cys328Tyr]替換亦可由NYX突變產(chǎn)生，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中沒(méi)有裝配的蛋白聚集進(jìn)而影響二硫鍵形成，表現(xiàn)為視蛋白合成障礙出現(xiàn)色覺(jué)異常[5]，LRIT3突變不僅會(huì)使ON-BCs信號(hào)通路異常，還會(huì)導(dǎo)致高度近視產(chǎn)生［6］。

LRIT3對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（fibroblast growth factor receptor, FGFR1）有調(diào)控作用［7］，突變的LRIT3會(huì)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)出有缺陷的FGFR1從而不能夠準(zhǔn)確的使FGFR1信號(hào)通路分支PLC-γ（Phospholipase C-γ）激活；或者突變的LRIT3不能成功將FGFR1裝配，從而使PLC-γ持續(xù)激活。異常的FGFR1信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致新生兒頜面部、顱骨發(fā)育異?；蚴前┌Y[7]。

Handong Dan等通過(guò)對(duì)我國(guó)8個(gè)不相關(guān)的cCSNB家系源頭研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的復(fù)合雜合子突變 體［8］，c.[1A>G];[608G>T](p.[0?]; p.[W203L])。c.[1A>G] (p.[0?])改變了LRIT3的起始密碼，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄無(wú)法開(kāi)始，因此轉(zhuǎn)錄只能在下一個(gè)ATG開(kāi)始，基因的閱讀框架相應(yīng)發(fā)生改變；c.[608G>T] (p.[W203L])是錯(cuò)義突變，位于LRIT3蛋白leucine-rich repeat C-terminal (LRRCT)結(jié)構(gòu)域201-253氨基酸之間，此結(jié)構(gòu)域?qū)儆诤塑账峤壎ǖ鞍准易?，?duì)自身免疫有調(diào)節(jié)作用。以上突變均可使LRIT3蛋白合成障礙。

1.2 LRIT3突變動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀

在敲除了LRIT3的等位基因或是因錯(cuò)義突變的動(dòng)物模型中，我們發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)類(lèi)似的b波的缺如，用免疫印記的方法也未能檢測(cè)到ON-雙極細(xì)胞樹(shù)突[3]上LRIT3的表達(dá)，從而驗(yàn)證了LRIT3在動(dòng)物模型ON-雙極細(xì)胞介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上的重要作用。

LRIT3突變大鼠模型：該模型在暗適應(yīng)及明適應(yīng)條件下，ERG的b波均嚴(yán)重下降或缺失，稱(chēng)為no b-wave (nob)，與人LRIT3突變致cCSNB的ERG表現(xiàn)一致；分別在6周、6個(gè)月時(shí)對(duì)其標(biāo)記，故稱(chēng)為nob6[9]。nob6為攜帶敲除了LRIT3的等位基因純合子突變體，外顯子3和4被刪除、Bgeo/Purocassette插入此區(qū)域，前8對(duì)堿基包含一個(gè)未成熟的終止密碼子(c.611_2046delinsGGCCATAG)，使LRIT3蛋白缺少206個(gè)氨基酸，其中包含跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域和PDZ-結(jié)合模序，繼而ON-BCs無(wú)法去極化，出現(xiàn)與人相關(guān)基因突變一致的夜盲的表現(xiàn)［9］。

LRIT3突變?nèi)Ｐ停篟ueben等通過(guò)對(duì)ERG表現(xiàn)為cCSNB的比格犬［11］模型研究，發(fā)現(xiàn)在32號(hào)染色體上一個(gè)4.6Mb位點(diǎn)，運(yùn)用全基因組相關(guān)研究和全基因組測(cè)序的方法確定了LRIT31個(gè)單一堿基刪除的純合子突變（CFA32: 30,038,862_30,038,863delG）此移碼突變?cè)斐蒐RIT3縮短，運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法可檢測(cè)到其視網(wǎng)膜ON-BCs樹(shù)突上強(qiáng)度減弱的免疫標(biāo)志物［12］。

2 LRIT3蛋白結(jié)構(gòu)及突觸后信號(hào)復(fù)合體研究現(xiàn)狀

LRIT蛋白超家族包含多種亞型，在結(jié)構(gòu)上的共同特點(diǎn)為跨膜結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞膜發(fā)生去極化及超極化時(shí)，其跨膜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)能夠?qū)㈦娦盘?hào)傳導(dǎo)至突觸后信號(hào)復(fù)合體。

2.1 LRIT3蛋白

LRIT3蛋白屬于LRR（leucine-rich repeat, LRR）家族蛋白成員。LRR首次由Takahashi 等在1985年通過(guò)對(duì)人血清leucine-rich α2-glycoprotein測(cè)序分離提?。?0］，并描述其是一種細(xì)胞膜起源、與細(xì)胞膜相關(guān)的蛋白，包括一系列具有雙極性的結(jié)構(gòu)域；其在細(xì)胞黏附，胞內(nèi)物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有重要作用，主要表達(dá)于中樞和視網(wǎng)膜。

LRIT3蛋白包括1個(gè)單肽（1—19氨基酸）和4個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域（82—104, 106—128, 130—152和154—176），其側(cè)面是cysteine-rich LLRNT（20—61氨基酸）和LRRCT（201—253氨基酸）模序；除此之外還包括免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（254—344氨基酸），纖維連接蛋白Ⅲ（484—574氨基酸），跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域（583—633氨基酸）。C-末端區(qū)域高度保守可能隱含一個(gè)PDZ結(jié)合模序［13］，另外，LRIT3蛋白包含1個(gè)serine-rich 區(qū)域 (氨基酸373—433)和2個(gè)半胱氨酸殘基, Cys275和Cys328, 合成二硫鍵［2］。

2.2 突觸后信號(hào)復(fù)合體

TRPM1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并由高爾基體修飾后進(jìn)入胞漿，Pearring等研究表明TRPM1在ON-BCs樹(shù)突上的正確定位需要mGluR6/GRM6和NXY的表達(dá)［10］；NXY位于細(xì)胞外，其與LRIT3細(xì)胞內(nèi)PDZ結(jié)合模序相互作用［14］使TRPM1定位于光感受器與ON-BCs樹(shù)突上并維持一定水平，NXY還在TRPM1的合成，及其在ON-BCs樹(shù)突上穩(wěn)定表達(dá)發(fā)揮作用[15]。

GPR179能夠正確定位G蛋白信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)因子（regulator of G protein signaling proteins, RGS）從而使G蛋白激活。Ray等推測(cè)NXY、mGluR6、GPR179和TRPM1形成突觸后信號(hào)通路復(fù)合體，LRIT3蛋白在復(fù)合體相關(guān)蛋白（mGluR6、TRPM1、GPR179、NXY、RGS7、RGS11、R9AP、Gα0、Gβ13、Gβ5）的表達(dá)上起決定性作用[16,17]。

3 LRIT3蛋白在錐細(xì)胞-ON-BCs突觸形成及信號(hào)傳導(dǎo)的特異性作用

錐細(xì)胞以?xún)?nèi)陷的方式與ON-BCs形成突觸，以平坦的方式與OFF-BCs聯(lián)系，其末端釋放的谷氨酸鹽經(jīng)過(guò)突觸絲帶彌散至突觸后分別與ON-BCs表面的GRM6、OFF-BCs表面的離子型谷氨酸受體（ionotropic glutamate receptor, IGR）相結(jié)合［18］，在光刺激下分別使ON-BCs去極化及OFF-BCs超極化。因LRIT3只是對(duì)mGluR6、TRPM1的表達(dá)、定位起到?jīng)Q定性作用，并不對(duì)IGR構(gòu)成影響，所以L(fǎng)RIT3突變致cCSNB的ERG d波得以保留。

Neuillé 等利用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)得Lrit-3nob6/nob6大鼠模型錐細(xì)胞-ON-BCs樹(shù)突數(shù)目減少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞ON-反應(yīng)相應(yīng)減弱［19］，錐細(xì)胞-OFF-BCs樹(shù)突數(shù)目相對(duì)增加，突觸絲帶發(fā)生擁擠，谷氨酸鹽攝取障礙表現(xiàn)為OFF-d波峰時(shí)延遲。與人LRIT3突變致cCSNB的OFF反應(yīng)無(wú)變化不一致，推測(cè)其由不同物種錐細(xì)胞系統(tǒng)存在差異引起。LRIT3蛋白對(duì)錐細(xì)胞與ON-BCs突觸的形成、突觸數(shù)量及對(duì)ONBCs信號(hào)傳導(dǎo)通路有特異性作用。

因cCSNB可以表現(xiàn)為X連鎖隱性遺傳及常染色體隱性遺傳［2］，突變檢出率較低，其眼底表現(xiàn)多正常，無(wú)視網(wǎng)膜色素沉著，伴或不伴后極部橢圓體帶的變薄；目前對(duì)NYX、GRM6、TRPM1和GPR179突變的研究已較為成熟，LRIT3為近年來(lái)新檢測(cè)出的突變基因，編碼的LRIT3在中樞及視網(wǎng)膜均有表達(dá)，由于LRIT3的雙極性及含有多種跨膜功能結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，其在細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及突觸間遞質(zhì)傳遞有調(diào)節(jié)作用。在光感受器細(xì)胞特別是錐細(xì)胞與ON-BCs突觸形成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有特異性作用。LRIT3突變致突觸后mGluR6、TRPM1表達(dá)的缺失，致使ON-BCs無(wú)法去極化，b波無(wú)法產(chǎn)生，從而出現(xiàn)穩(wěn)定無(wú)進(jìn)展的夜盲癥狀及高度近視、眼球震顫及色覺(jué)異常等臨床表現(xiàn)，對(duì)于LRIT3突變現(xiàn)多停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，未來(lái)需要進(jìn)一步闡明其在先天性靜止性夜盲上的發(fā)病機(jī)制。