楊 帆, 李優(yōu)佳, SHAMEER K S, 閻 偉, 呂寶乾, 蔣方一丁, 章雨璐, 涂 艷, 齊可欣

(1.海南大學(xué)林學(xué)院，海南 海口 570228；2.熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南?？?570228；3.Insect Ecology & Ethology Laboratory, Department of Zoology, University of Calicut,Calicut 673635, India; 4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339；5.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101)

我國(guó)高溫、高濕的熱帶地區(qū)自然氣候條件十分優(yōu)越，生物資源多種多樣，為外來入侵物種的定殖、擴(kuò)散和暴發(fā)提供了適宜的氣候和食物條件[1-2].椰子織蛾(OpisinaarenosellaWalker)來源于印度和斯里蘭卡，是近年來發(fā)現(xiàn)危害熱帶棕櫚科植物的重要入侵食葉害蟲.該蟲最早于19世紀(jì)中期被發(fā)現(xiàn)，此后相繼在緬甸、印度、孟加拉、印度尼西亞、泰國(guó)、馬來西亞、巴基斯坦等地發(fā)現(xiàn)其危害[3-5]；2013年入侵我國(guó)，現(xiàn)已擴(kuò)散至海南、廣西、福建和廣東等地[6-8],嚴(yán)重影響椰子種植業(yè)的發(fā)展以及城市公共綠地的美觀.鑒于其危害性，中華人民共和國(guó)國(guó)家林業(yè)局2014年正式把椰子織蛾列為危險(xiǎn)性有害生物[9]，2019年該蟲被認(rèn)定為三級(jí)危害性林業(yè)有害生物[10].國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)椰子織蛾的研究主要集中在防治方面，有關(guān)其發(fā)生趨勢(shì)的有效監(jiān)測(cè)報(bào)道較少.明確椰子織蛾的入侵信息可有針對(duì)性地進(jìn)行監(jiān)測(cè)預(yù)警,從而有利于綜合防控措施的實(shí)施[11]，因此，準(zhǔn)確把握該蟲入侵來源是對(duì)其防控技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用的科學(xué)基礎(chǔ)[12].

線粒體DNA因具有缺乏重組、突變率高、單倍體母系遺傳等特點(diǎn)，被作為分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于昆蟲種群遺傳變異和系統(tǒng)地理學(xué)的研究[13-14].學(xué)者已基于COⅠ基因分析了椰子織蛾不同地理種群的單倍型特征，其原產(chǎn)地與入侵地的單倍型存在一定的差異[15]，但未系統(tǒng)深入分析.本研究利用COⅠ、COⅡ和COⅢ 3個(gè)基因片段分析原產(chǎn)地與入侵地椰子織蛾種群的遺傳分化特征，以期為實(shí)施有效的檢驗(yàn)檢疫措施和監(jiān)測(cè)其入侵動(dòng)態(tài)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本來源

于2018—2019年在原產(chǎn)地(印度)和入侵地(中國(guó)、馬來西亞、泰國(guó)和印度尼西亞)采集椰子織蛾樣品，將采集的新鮮樣品儲(chǔ)存于無水乙醇中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?選取其中107份樣品進(jìn)行試驗(yàn)，其來源地見表1.

表1 原產(chǎn)地和入侵地椰子織蛾樣品信息Table 1 Information of O.arenosella samples from the place of origin and invasive areas

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)MagBeads Tissues Gen DNA Extraction Kit試劑盒說明書提取基因組DNA.所有樣品的DNA質(zhì)量在超微量紫外分光光度計(jì)下測(cè)定，D260 nm/D280 nm值均在1.7～2.0之間，將提取的DNA稀釋至500 ng·μL-1后保存在-20 ℃冰箱備用.

根據(jù)椰子織蛾線粒體基因組的序列[16]，分別設(shè)計(jì)COⅠ、COⅡ和COⅢ基因擴(kuò)增片段的特異性引物，引物序列詳見表2.各基因PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq Plus Master Mix 10.0 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、Template 1.0 μL (0.1 μg)、ddH2O 7.4 μL.PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，15個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)降1 ℃)之后95 ℃預(yù)變性30 s，50 ℃變性30 s，72 ℃退火60 s，28個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后修復(fù)延伸10 min.PCR產(chǎn)物測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成.

表2 椰子織蛾mtDNA-COⅠ、COⅡ和COⅢ基因片段引物Table 2 Primers for mtDNA-COⅠ、COⅡ and COⅢ gene fragments of O.arenosella

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用BioEdit軟件對(duì)3個(gè)基因序列進(jìn)行比對(duì)和人工修正，去除兩端低質(zhì)量序列并區(qū)分雜合位點(diǎn)，以獲得準(zhǔn)確的基因片段序列[17].使用MEGA 6.0軟件[18]分析序列的堿基組成和多態(tài)位點(diǎn)，并選取Kimura-2參數(shù)模型，以鄰接(neighbor joining, NJ)法構(gòu)建不同地理種群的系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度用自舉檢驗(yàn)法(bootstrap)檢驗(yàn)，共進(jìn)行1 000次循環(huán).利用PhyloSuite中的MrBayes[19]構(gòu)建BI(Bayesian inference)樹，依據(jù)ModelFinder[20]選擇最佳替換模型為GTR+F.

2 結(jié)果與分析

通過基因序列比對(duì)分析，獲得12個(gè)不同地理種群的107條COⅠ、COⅡ和COⅢ基因序列.經(jīng)過拼接和引物刪除，COⅠ、COⅡ和COⅢ基因序列片段長(zhǎng)度分別為1 362、623和687 bp.從COⅠ基因序列鑒定出4種基因型(圖1A)，從COⅡ和COⅢ基因序列分別鑒定出3種基因型(圖1B、1C).來自中國(guó)、馬來西亞、泰國(guó)和印度尼西亞的椰子織蛾種群均為同一種基因型.

將COⅠ、COⅡ和COⅢ 3個(gè)基因片段序列拼接，序列比對(duì)顯示其共包含35個(gè)變異位點(diǎn)，其中97%為堿基轉(zhuǎn)換，3%為堿基顛換.在核苷酸組成上，原產(chǎn)地與入侵地種群的A、T、C和G的平均含量均分別為31.3%、41.7%、14.5%和12.5%，共存在34個(gè)變異位點(diǎn)，38%為嘌呤轉(zhuǎn)換，62%為嘧啶轉(zhuǎn)換.

將本研究測(cè)定的3個(gè)線粒體基因序列進(jìn)行拼接，并以白胸織蛾(Endrosissarcitrella)COⅠ+COⅡ+COⅢ序列為外群，分別構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯樹(圖2).結(jié)果表明：所有入侵地的椰子織蛾基因序列聚成一支，支持率為100%；入侵地與原產(chǎn)地椰子織蛾種群形成兩個(gè)明顯的分支，遺傳距離為1.3%(表3).

3 討論

COⅠ、COⅡ、COⅢ是線粒體中最為保守的基因, 同源性為80%左右,所以其序列可作為研究物種系統(tǒng)進(jìn)化和分類的有效分子標(biāo)記[21].本研究選取COⅠ、COⅡ和COⅢ基因?qū)υa(chǎn)地與入侵地椰子織蛾種群進(jìn)行檢測(cè)，A、T、C、G核苷酸的分布呈現(xiàn)非均一性，原產(chǎn)地與入侵地種群的各堿基占比相同.在35個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)中，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率遠(yuǎn)高于顛換，該結(jié)果符合線粒體基因組進(jìn)化規(guī)律.

本研究表明，入侵地區(qū)的椰子織蛾線粒體COⅠ、COⅡ和COⅢ基因與原產(chǎn)地種群基因的遺傳距離為1.3%，低于普遍接受的種間遺傳距離[13,22-24].系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，椰子織蛾存在兩個(gè)遺傳支系，即原產(chǎn)地支系與入侵地支系，表明椰子織蛾種群已出現(xiàn)明顯的遺傳分化.如果這兩個(gè)支系在形態(tài)和行為上出現(xiàn)差異，從進(jìn)化的角度來說，可能發(fā)展為兩個(gè)亞種.例如：與此類似的入侵害蟲美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)，在其原產(chǎn)地存在兩種幼蟲頭殼色型[25]；草地貪蛾(Spodopterafrugiperda)在原產(chǎn)地美洲長(zhǎng)期進(jìn)化過程中分化成兩種生態(tài)型[26-27].

入侵地區(qū)椰子織蛾線粒體單倍型的多樣性較低，而原產(chǎn)地種群則不然.這種低遺傳多樣性通常是由初始的少數(shù)個(gè)體直接造成的，這些初始種群在入侵的早期階段會(huì)受到強(qiáng)烈的遺傳漂變或奠基者效應(yīng)的影響[28]，種群經(jīng)歷的奠基者效應(yīng)越多，其遺傳多樣性喪失越多[29].有研究認(rèn)為該過程并非是不利的：一方面，通過遺傳漂變和小種群中的非隨機(jī)交配可以清除種群中的有害等位基因[30]；另一方面，入侵地種群受環(huán)境選擇壓力的影響在新棲息地產(chǎn)生新的突變或雜交，可能預(yù)示這個(gè)物種侵占新領(lǐng)地的進(jìn)化潛力.從寄主范圍來看，椰子織蛾在其原產(chǎn)地主要危害椰子、海棗、董棕、油棕、野生棗椰、甘藍(lán)椰子[31-32]，入侵后，該蟲還可危害多種景觀樹木，如酒瓶椰子、大王棕、銀海棗、檳榔等[33-34]，寄主范圍進(jìn)一步擴(kuò)大.可見，椰子織蛾在與新環(huán)境中寄主植物的互作過程中產(chǎn)生了遺傳變異和分化，以適應(yīng)不同的環(huán)境，進(jìn)而擴(kuò)大了其分布范圍.

入侵我國(guó)不同地區(qū)的椰子織蛾種群在線粒體基因組水平上未出現(xiàn)堿基變異，可能是由于其傳入時(shí)間較短，尚未產(chǎn)生遺傳分化.入侵我國(guó)的椰子織蛾與馬來西亞、泰國(guó)以及印度尼西亞種群聚為一支，且它們具有完全一樣的基因型，而該蟲入侵馬來西亞、泰國(guó)以及印度尼西亞的時(shí)間較我國(guó)早，推測(cè)入侵我國(guó)的椰子織蛾種群可能來源于這些國(guó)家.