薄威 王旭光 李佳琦 梁伊靈 李磊 勾佳鈺 張忠

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室（沈陽(yáng)110034）

胃癌是一種很常見的惡性腫瘤，并且是全世界惡性腫瘤死亡的最常見原因之一［1］。這是由于胃癌常常在晚期才被診斷出來(lái)。而對(duì)于中晚期胃癌的治療，臨床醫(yī)生只能對(duì)癥治療而不能將其完全治愈［2］。如果胃癌在早期就被發(fā)現(xiàn)，患者的生存質(zhì)量將大大提高，所以對(duì)于胃癌早期的生物學(xué)標(biāo)志物篩查尤為重要。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的感染是胃癌的危險(xiǎn)因素［3］。但是在H.pylori感染的人群中，感染者發(fā)生非萎縮性胃炎較為普遍，僅有少數(shù)感染者會(huì)發(fā)生胃癌。這種狀況的出現(xiàn)與宿主特性、環(huán)境因素及H.pylori毒力因子密切相關(guān)［4］。近年來(lái)，對(duì)于H.pylori毒力因子的研究越發(fā)深入，空泡毒素（vacuolating cytotoxin，VacA）逐漸進(jìn)入到人們的視野，編碼空泡毒素的基因序列上存在多態(tài)性位點(diǎn)，不同基因亞型的組合與胃癌的關(guān)系不同［5］。目前，H.pylori vacA基因亞型在遼寧胃癌患者中的分布尚不十分明確，其與胃癌發(fā)生的機(jī)制尚需研究。核因子（NF-κB）是一種功能性蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細(xì)胞的胞漿。研究發(fā)現(xiàn)，作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 在很多疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，NF-κB 的上調(diào)可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄活性而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6］。因此，本研究主要闡明胃癌患者術(shù)后組織中檢測(cè)H.pylori vacA基因亞型與NF-κB 的表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源選取2010年7月至2014年7月本院普外科胃癌患者手術(shù)切除的H.pylori陽(yáng)性石蠟包埋胃癌組織樣本140例。其中男108例，女32例，年齡28～87 歲，年齡中位數(shù)為60 歲，本研究已獲得沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 DNA提取蠟塊每例連續(xù)切15 ～20片，每片厚度為4 μm，置于1.5 mL 離心管中，按試劑盒（購(gòu)于北京天根公司，DP331-02）說(shuō)明書操作提取DNA。

1.3 PCR 檢測(cè)H.pyloris 序列和m 序列的特異引物，通過(guò)巢式PCR 對(duì)vacA s1、s2、m1和m2進(jìn)行擴(kuò)增，引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)。按照既往文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物序列，確定反應(yīng)條件［7］。電泳后分析結(jié)果。

1.4 NF-κB 蛋白表達(dá)檢測(cè)采用ElivisionTMplus法檢測(cè)NF-κB 的表達(dá)情況。兔抗人NF-κB 多抗購(gòu)（ab16636）購(gòu)買于美國(guó)abcam 公司。NF-κB 抗體（1∶400）稀釋，4 ℃過(guò)夜，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.5 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性結(jié)果判定，細(xì)胞中棕褐色或棕黃色顆粒，著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色［8］。顯微鏡下觀察10 個(gè)高倍視野，對(duì)100 個(gè)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)和評(píng)分，將陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分及染色強(qiáng)度評(píng)分相乘得分，0 ～1 分為陰性、2 ～3 分為弱陽(yáng)性、4 ～6 分為中度陽(yáng)性、7 ～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.6 觀察指標(biāo)觀察胃癌組織中vacA的不同亞型以及NF-κB 的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析對(duì)影響因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料本研究選取140 例H.pylori陽(yáng)性胃癌患者組織一般資料見表1。

表1 胃癌患者一般資料Tab.1 Clinical data of patients with gastric cancer 例（%）

2.2 不同H.pylori vacA基因亞型在胃癌中的分布s1產(chǎn)物片段141 bp，s2產(chǎn)物片段153 bp；m1產(chǎn)物片段102 bp；m2產(chǎn)物片段102 bp。在胃癌組織中分析s和m亞型的表達(dá)情況，vacAs1亞型（88∕140，62.90%）高于vacAs組其他亞型（P＜0.05）；vacAm1亞型（52∕140，37.14%）在胃癌中的分布高于vacAm組其他亞型（P＜0.05）；聯(lián)合分析s與m亞型的表達(dá)，vacAs1m1亞型（35∕140，25.00%）在胃癌中比率均高于其他亞型（P＜0.05）。見表2。

2.3 H.pylori vacA優(yōu)勢(shì)基因型與胃癌Lauren 分型觀察H.pylori vacA不同基因亞型與臨床病理特征的關(guān)系，vacA不同基因亞型只與Lauren 分型有關(guān)。vacAs1在腸型胃癌和彌散型胃癌中的檢出率都為50%，在兩型胃癌比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。vacAm1在彌散型胃癌中檢出率為61.45%高于在腸型胃癌中的檢出率38.46%；vacAs1m1基因型在彌散性胃癌檢出率為74.28%高于腸型胃癌中的檢出率25.71%，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見表3。

2.4 NF-κB 表達(dá)與胃癌患者臨床病理特性結(jié)果顯示，NF-κB 的表達(dá)與年齡、腫瘤直徑、TNM 分期、部位和Lauren 分型均無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但其表達(dá)與性別和淋巴轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，其中男性患者NF-κB 表達(dá)明顯高于女性患者。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中NF-κB 的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.01）。見圖1、表4。

2.5 H.pylorivacA優(yōu)勢(shì)基因型與NF-κB 表達(dá)H.pylori vacAs1、vacAm1、vacAs1m1亞型會(huì)明顯影響NF-κB表達(dá)（P＜0.05），并且當(dāng)此三種基因型為陽(yáng)性時(shí)，NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高。其余vacA基因亞型則未有明顯影響（P＞0.05）。見表5。

表2 不同H.pylori vacA 基因亞型在胃癌中的分布Tab.2 Distribution of different H.pylori vacA gene subtypes in gastric cancer 例（%）

表3 H.pylori vacA 優(yōu)勢(shì)基因型與胃癌Lauren 分型之間的關(guān)系Tab.3 The relationship between the dominant genotype of H.pylori vacA and the Lauren classification of gastric cancer

圖1 NF-κB 表達(dá)Fig.1 Expression of NF-κ B（400×）

3 討論

在全球惡行腫瘤發(fā)病率中胃癌位于前5位并是第三大癌癥死亡原因。在胃癌晚期患者中，其5年生存率僅約10%，2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新增胃癌人數(shù)高達(dá)40萬(wàn)，病死率位列癌癥相關(guān)病死率第2 位［7］。我國(guó)胃癌的發(fā)病率和病死率均高于世界的其他國(guó)家，對(duì)人民的生命健康和生存質(zhì)量造成了巨大威脅。流行病學(xué)研究顯示3∕4的人類胃癌患者是由H.pylori引起的［8］。H.pylori在全球發(fā)病率超過(guò)50%，尤其在各條件相對(duì)較低地區(qū)，發(fā)病率更高，其被WHO 癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為Ⅰ類致癌原。研究已證明H.pylori分泌VacA 蛋白致使細(xì)胞空泡化改變，損耗線粒體跨膜電位，釋放細(xì)胞色素C，激活促凋亡因子Bcl-2 等相關(guān)蛋白，從而引起一系列炎性反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。H.pylori感染后，可提高mir-135b-5p 的水平抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)順鉑耐藥，還可激活NF-κB 信號(hào)通路參與胃癌發(fā)生［9］。在遼寧省惡性腫瘤主要死因之一便是胃癌［10］。

表4 NF-κB 表達(dá)與胃癌患者臨床病理特性的關(guān)系Tab.4 Relationship between NF-κB expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients 例（%）

表5 H.pylori vacA 優(yōu)勢(shì)基因型與NF-κB 表達(dá)的關(guān)系Tab.5 The relationship between the dominant genotypes of H.pylori vacA and the expression of NF-κB例（%）

筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，vacAs1m2與萎縮性胃炎和腸上皮化生的發(fā)生密切相關(guān)［11］。筆者在前期研究基礎(chǔ)上想進(jìn)一步分析在遼寧地區(qū)胃癌患者中vacA基因的亞型分布，以及檢測(cè)有H.pylori感染的胃癌組織中NF-κB 的表達(dá)情況，在組織學(xué)層面分析分析vacA基因亞型與NF-κB 之間的關(guān)系。在對(duì)收集的胃癌組織樣本進(jìn)行vacA基因亞型分析后發(fā)現(xiàn)，vacA（s1、m1和s1m1）三種基因亞型在胃癌中的分布高于其他亞型。結(jié)果還顯示vacAm1和vacAs1m1基因型在彌散型胃癌中比例高于腸型胃癌，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，攜帶vacAm1和vacAs1m1基因型的胃癌患者，臨床預(yù)后差。NF-κB為參與疾病進(jìn)展的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子［12］，H.pylori致胃癌機(jī)制中可能存在NF-κB 信號(hào)通路受到miR-338 靶向抑制C-C 基序趨化因子配體21 調(diào)控［13］。

既往研究已證實(shí)H.pylori感染造成胃黏膜致炎狀態(tài)后，可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB的表達(dá)，這說(shuō)明NF-κB 的高表達(dá)與胃癌的發(fā)生是密切相關(guān)的［14］。本研究通過(guò)對(duì)臨床病理資料的分析后顯示，NF-κB 的表達(dá)在胃癌中與性別和淋巴轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析vacA不同基因型對(duì)核因子NF-κB表達(dá)的影響，結(jié)果顯示僅vacA三個(gè)優(yōu)勢(shì)基因型（s1、m1與s1m1）與NF-κB 的表達(dá)呈正相關(guān)。目前，vacA與NF-κB 的直接作用機(jī)制研究尚無(wú)報(bào)道，需要進(jìn)一步探索。大量體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)H.pylori感染可誘導(dǎo)尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2 的表達(dá)。學(xué)者在人類胃癌細(xì)胞AGS 的研究中發(fā)現(xiàn)，在H.pylori感染的條件下，尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2 表達(dá)通過(guò)激活NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌癌前病變的發(fā)生［15］；另外SAMADANI等在胃癌細(xì)胞系（AGS、NUGC-4、KATOIII）的研究中顯示，毒素相關(guān)蛋白（CagA）陽(yáng)性（含有致病島）H.pylori菌株能引起CDX2 蛋白水平和mRNA 水平增高［16］。YOON 等［17］選用兩種26695 有致病島的H.pylori菌株和TX30 無(wú)致病島的菌株感染AGS 細(xì)胞，并于24 h 后加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，研究顯示在26695 有致病島菌株中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2下游蛋白SMAD4和p-SMAD1∕5∕8 均增高，同時(shí)NF-kB 水平也出現(xiàn)了相應(yīng)的改變。同樣在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示H.pylori通過(guò)骨形態(tài)發(fā)生蛋白途徑調(diào)節(jié)NF-κB（上調(diào)）、SOX2（下調(diào)）的水平，進(jìn)而影響胃癌的進(jìn)展，但是多局限于cagA 基因亞型上。

綜上，vacA（m1、s1和s1m1）三種基因亞型在遼寧地區(qū)是胃癌發(fā)生的優(yōu)勢(shì)基因型，攜帶vacAs1m1基因亞型的患者可能是彌散型胃癌的高發(fā)人群，促進(jìn)NF-κB 的表達(dá)應(yīng)是導(dǎo)致胃癌惡化的可能路徑之一。對(duì)于vacA基因亞型的深入研究對(duì)于胃癌的早期診斷有重要的意義，同時(shí)，本研究為胃癌的發(fā)生機(jī)制及因型施治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。但是，本文也有一定的局限性，僅在患者組織中檢測(cè)了NF-κB的表達(dá)情況，下一步需要在體外用分子實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。