于學(xué)龍，郈秀菊，張素文，李紅梅，劉陽(yáng)，鐘華風(fēng)，李俊起

(山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南 250101)

1 引 言

酶標(biāo)儀廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)中，是對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專業(yè)儀器。其依據(jù)酶標(biāo)記的復(fù)合物與酶的相應(yīng)底物能夠產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顯色的深度與被測(cè)樣本的濃度正相關(guān)，不同物質(zhì)有其特有的特征吸收譜線，并遵守朗伯比爾(Lambert-beer)定律，可根據(jù)顯色物質(zhì)吸光度值定量測(cè)定物質(zhì)的含量[1-2]。Lambert-beer定律的表達(dá)式如下：

(1)

式中,A為吸光度；T為透射比，等于出射光強(qiáng)度(I)比入射光強(qiáng)度(I0)；K為摩爾吸光系數(shù)，與吸光物質(zhì)和入射光的波長(zhǎng)λ有關(guān)，單位為L(zhǎng)/(g·cm);B為吸收層厚度，單位為cm;c為吸光物質(zhì)的濃度，單位為g/L。

目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的酶標(biāo)儀比較簡(jiǎn)單、測(cè)量精度低，高檔的酶標(biāo)儀仍以進(jìn)口為主[3]。為了實(shí)現(xiàn)高穩(wěn)定性、高精度、快速檢測(cè)的目標(biāo)，本研究基于雙CPU的控制方案，樣本區(qū)域采取恒溫控制，采用一路參比信號(hào)通道和十二路檢測(cè)通道[4]，設(shè)計(jì)了一種可快速檢測(cè)12×8(96)微孔板和12×32(384)微孔板的多通道酶標(biāo)儀。

2 方法

2.1 光學(xué)系統(tǒng)

本酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)見圖1，采用鹵素?zé)糇龉庠?，波長(zhǎng)范圍340～800 nm，其發(fā)出的光經(jīng)過(guò)平面反射鏡照射到聚光透鏡上，再經(jīng)過(guò)濾光片變成單色光[5]，在光纖接頭處形成一個(gè)單色的光斑(光斑直徑大于光纖接頭的直徑)。光纖將單色光引導(dǎo)到參比通道(1路)和檢測(cè)通道(12路)，單色光自下而上照射通道內(nèi)的樣本(參比通道內(nèi)無(wú)樣本)，透射光照射到通道上方的光電池，光電池把透射光信號(hào)成比例轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，經(jīng)過(guò)前置放大器的放大作用轉(zhuǎn)換為可供單片機(jī)使用的電壓信號(hào)[6-7]。本酶標(biāo)儀配置405、450、490、630 nm四個(gè)濾光片，預(yù)留四個(gè)選配濾光片位置，最多可安裝八個(gè)濾光片。

圖1 光學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Optical structure diagram

2.2 電路結(jié)構(gòu)

采用宏晶科技有限公司的STC15W4K40S4和STC15F2K40S2組成雙CPU結(jié)構(gòu)，見圖2。直流電源模塊輸出5 V和24 V電壓，其中5 V供給單片機(jī)系統(tǒng)，24 V供給兩個(gè)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器和鹵素?zé)趄?qū)動(dòng)器。一個(gè)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)微孔板進(jìn)出酶標(biāo)儀的檢測(cè)艙室；另一個(gè)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)濾光片架，便于調(diào)整濾光片。STC15W4K40S4為主控單片機(jī)，是8位單周期單片機(jī)，有40 K片內(nèi)flash存儲(chǔ)器、18 K的EEPROM、4 K的SRAM，還具有4組獨(dú)立的異步串行通訊接口，通過(guò)分時(shí)切換可當(dāng)作9組串行接口使用。4組串行接口通過(guò)電平變換以后，可分別與液晶觸摸屏、打印機(jī)、U盤、PC上位機(jī)連接。液晶觸摸屏顯示酶標(biāo)儀的相關(guān)信息，并且可以輸入指令；打印機(jī)輸出測(cè)試結(jié)果；U盤可存儲(chǔ)相關(guān)信息，用于轉(zhuǎn)移到其他設(shè)備上；利用PC機(jī)強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理能力與PC上位機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)通訊。主單片機(jī)通過(guò)16位的模數(shù)轉(zhuǎn)換器AD977將經(jīng)過(guò)前置放大的光電池[8]信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。主控單片機(jī)與從單片機(jī)STC15F2K40S2通過(guò)串行接口進(jìn)行通訊。主控單片機(jī)通過(guò)兩路THB6128驅(qū)動(dòng)微孔盤托架步進(jìn)電機(jī)和濾光片架步進(jìn)電機(jī)，通過(guò)一路L296控制鹵素?zé)糸_關(guān)。

圖2 電氣控制框圖Fig.2 Block diagram of electrical control

從單片機(jī)STC15F2K40S2也是8位單周期單片機(jī)，有40 K片內(nèi)flash存儲(chǔ)器、21 K的EEPROM、2 K的SRAM，具有2組獨(dú)立的異步串行通訊接口。從單片機(jī)控制2個(gè)風(fēng)扇、3個(gè)加熱器，為酶標(biāo)儀內(nèi)部供應(yīng)熱空氣，并通過(guò)6個(gè)熱敏電阻實(shí)時(shí)檢測(cè)相應(yīng)位置的溫度，確保樣本區(qū)域的溫度恒定，提高酶標(biāo)儀整體的檢測(cè)精度和穩(wěn)定性。

2.3 軟件控制

軟件設(shè)計(jì)采用模塊化編程的思路，用C語(yǔ)言編寫各個(gè)模塊[9]，總程序的流程見圖3。軟件部分共有測(cè)試、設(shè)置、分析、數(shù)據(jù)、維護(hù)五個(gè)模塊,見圖4。測(cè)試模塊控制線性校準(zhǔn)和樣本測(cè)試；設(shè)置模塊用于設(shè)置當(dāng)前檢測(cè)所使用微孔板的規(guī)格、濾光片的規(guī)格以及所需恒溫的溫度值；分析模塊用于選擇合適的方法經(jīng)，處理檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)模塊用于選擇數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的型式和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移；維護(hù)模塊用于確定關(guān)鍵配件的更換信息。

圖3 軟件流程框圖Fig.3 Software flow diagram

圖4 軟件部分Fig.4 Software part

2.4 機(jī)械驅(qū)動(dòng)

采用兩相混合式步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)微孔板托架和濾光片架的移動(dòng)，采用THB6128芯片驅(qū)動(dòng)步進(jìn)電機(jī)。該芯片具有雙橋MOSFET驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)通電阻低至0.55 Ω，驅(qū)動(dòng)電壓高達(dá)36 V，有多種細(xì)分可供選擇，最高到1/128細(xì)分，可有效保證微孔板托架和濾光片移動(dòng)位置的準(zhǔn)確性。步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路見圖5。

圖5 步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)電路Fig.5 Stepper motor drive circuit

3 檢驗(yàn)

我們根據(jù)《JJG 861-2007 酶標(biāo)分析儀檢定規(guī)程》的要求，采用重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行校驗(yàn)，重點(diǎn)對(duì)吸光度和通道差異性進(jìn)行測(cè)量[10-12]。對(duì)酶標(biāo)儀配備的405、450、490、630 nm四個(gè)濾光片分別進(jìn)行校驗(yàn)，由于其過(guò)程相同，我們僅對(duì)405 nm濾光片的校驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果進(jìn)行研究。

使用Sartorius BT125D天平稱量分析純重鉻酸鉀0.500 g，少量蒸餾水溶解，加100 μL濃硫酸，使用100 mL容量瓶溶解，作為基準(zhǔn)原液(濃度0.500%)。用蒸餾水對(duì)基準(zhǔn)原液進(jìn)行倍比稀釋，取得濃度分別為0.250%、0.125%、0.0625%、0.0313%、0.0156%、0.00731%的稀釋液。

使用島津UV-2700分光光度計(jì)，設(shè)置波長(zhǎng)為405 nm，測(cè)試結(jié)果作為吸光度標(biāo)準(zhǔn)值A(chǔ)s；酶標(biāo)儀選用405 nm的濾光片，選用第一路通道，進(jìn)行吸光度示值誤差測(cè)試。進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果見表1。吸光度示值誤差△A按照式(2)進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)濃度值測(cè)量三次，依次進(jìn)行計(jì)算。

表1 各種濃度的示值和吸光度示值誤差Table 1 Errors of indications and absorbance indications of various concentrations

(2)

式中，Ai為同一濃度的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液第i次測(cè)量得到的吸光度值。As為吸光度標(biāo)準(zhǔn)值。

選用吸光度標(biāo)稱值為1.0的光譜中性濾光片[13]放置在酶標(biāo)儀微孔板的托架上，酶標(biāo)儀選用405 nm波長(zhǎng)的濾光片，依次進(jìn)行十二個(gè)通道的吸光度值測(cè)量，每個(gè)通道測(cè)量6次，按照式(3)計(jì)算通道差異δA。

δA=Amax-Amin

(3)

式中，Amax為多個(gè)通道中測(cè)量的吸光度的最大值。Amin為多個(gè)通道中測(cè)量的吸光度的最小值。δA為通道差異。

通過(guò)測(cè)量，吸收度最大值A(chǔ)max為1.022，最小值A(chǔ)min為0.995，δA=0.027，低于0.03，符合要求。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)96微孔板的12通道酶標(biāo)儀，通過(guò)穩(wěn)定的溫度控制，可實(shí)現(xiàn)快速、精確地測(cè)量。通過(guò)校準(zhǔn)檢驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)吸光度示值誤差小于0.015，通道差異小于0.03，基本滿足實(shí)際使用的要求。但在功能方面只能檢測(cè)吸光度，后續(xù)應(yīng)考慮擴(kuò)展熒光和化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)。此外，為了進(jìn)一步提高測(cè)量結(jié)果的可靠性，應(yīng)考慮采用雙波長(zhǎng)測(cè)量方法；在數(shù)據(jù)輸出方面，還需要豐富數(shù)據(jù)計(jì)算和處理能力，增加打印報(bào)告格式的種類，以增加檢測(cè)項(xiàng)目。以上不足之處，還需在后續(xù)的工作中進(jìn)一步作出改進(jìn)和完善。