普通培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)防城港海域真菌分離效果的影響*

劉思遠(yuǎn)，王巧貞，吳鴻仙，黃庶識(shí)，馮 潔**

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021；2.廣西科學(xué)院，廣西生物物理與環(huán)境科學(xué)研究中心，廣西南寧 530007)

0 引言

海洋真菌是海洋微生物的一個(gè)重要分支[1]，它們常以寄生或腐生的方式，在海洋或港灣生態(tài)環(huán)境中生長(zhǎng)[2，3]，并且參與有機(jī)物的分解和無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的再生過程，是維持海洋生態(tài)系統(tǒng)二氧化碳產(chǎn)生與固定之間動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵[4]。同時(shí)，由海浪與河流黏土沉積形成的港灣泥灘，是一種與沙灘不同的獨(dú)特環(huán)境[5]，海洋微生物為了適應(yīng)其特殊環(huán)境，往往發(fā)展出獨(dú)特的生命代謝途徑，由此能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異、生物活性特殊的次生代謝產(chǎn)物[6，7]。因此，分離、純化和鑒定海洋微生物，對(duì)于揭示當(dāng)?shù)睾Ｓ蛭⑸锓N類，保存菌種，建立樣品庫(kù)，提供研究海洋微生物藥物和農(nóng)藥的有效菌種[8]，以及進(jìn)一步研究其次生代謝產(chǎn)物及其生理活性等均有重要意義。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道常見真菌培養(yǎng)基的配方[9]，北部灣海域也發(fā)現(xiàn)多種具有生物活性的海洋真菌[10-12]，然而針對(duì)不同分離培養(yǎng)基及加入不同抑制劑的優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)海洋真菌分離效果及分離多樣性的系統(tǒng)研究報(bào)道較為少見。本文采用不同培養(yǎng)基對(duì)采自廣西防城港的海泥樣品進(jìn)行研究，運(yùn)用相對(duì)多度(Relative Abundance)、Simpson指數(shù)、Jaccard系數(shù)考察不同培養(yǎng)基在提取、分離、純化菌種時(shí)的效果，在達(dá)到高效分離純化菌種目標(biāo)的同時(shí)，又可以自主選擇分離樣品的多樣性與特異性，供同仁們參考；此外，分離得到的菌種還可以為后續(xù)海洋微生物的應(yīng)用研究及次生代謝產(chǎn)物研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海泥樣品

2017年12月23日，于防城港市(21°36′57″N，108°13′47″E)采集海泥樣品，采樣深度為海灘地面下15 cm處，將海泥樣品置于采樣袋中，用冰盒轉(zhuǎn)運(yùn)至廣西科學(xué)院生物物理與環(huán)境科學(xué)研究中心，于4℃冰箱中暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 普通培養(yǎng)基與優(yōu)化培養(yǎng)基

6種普通培養(yǎng)基(定容1 L)分別是MD普通培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)、PDA普通培養(yǎng)基(煮沸去除濾液的馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂14 g，無菌海水50%)、YPDA普通培養(yǎng)基(蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，葡萄糖2 g，0.2%腺嘌呤溶液15 mL，瓊脂20 g，無菌海水50%)、CA普通培養(yǎng)基(硝酸鈉3 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)、SA普通培養(yǎng)基(麥芽糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)及PA普通培養(yǎng)基(蛋白胨2 g，七水合硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，無菌海水50%)。各培養(yǎng)基使用去離子水配制，封口后在120℃下高溫滅菌30 min，冷卻至50℃時(shí)加入慶大霉素，使之濃度為50 μg/mL，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

優(yōu)化培養(yǎng)基以MD和PDA作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。8種抑制劑如下：青霉素20 μg/mL、鏈霉素50 μg/mL、氯霉素0.1 mg/mL、孟加拉紅1 mg/3 mL、青霉素20 μg/mL+慶大霉素50 μg/mL、鏈霉素50 μg/mL+慶大霉素50 μg/mL、青霉素20 μg/mL+氯霉素0.1 mg/mL、鏈霉素50 μg/mL+氯霉素0.1 mg/mL；后4種復(fù)合抑制劑以下簡(jiǎn)稱為青+慶、鏈+慶、青+氯、鏈+氯。

1.3 儀器與設(shè)備

滅菌的離心管及移液器槍頭，各量程的移液器。

SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、LHS-250SC恒溫恒濕箱(上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)、1-1SP小型臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)、070-851型熱循環(huán)儀(德國(guó)Biometra公司)、美國(guó)伯樂電泳儀系統(tǒng)、Omega Fluor凝膠成像儀(美國(guó)Aplegen公司)。

10%的chelex-100樹脂(購(gòu)自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；膠紅(購(gòu)自BIOTIUM公司)；引物ITS1、引物ITS4、5×loading buffer(購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司)；Taq PCR Master Mix酶、ddH2O(購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司)；Trans 15K DNA Marker(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.4 真菌分離

稱取2 g海泥置于裝有8 mL無菌水溶液的滅菌離心管中，震蕩后取上層懸濁液，用無菌水將其梯度稀釋1 000倍，分別取100 μL涂布于各培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基重復(fù)3次，每天觀察并記錄真菌生長(zhǎng)情況，通過菌落形態(tài)、顏色、大小來確定真菌種類，并編號(hào)留樣。

1.5 真菌純化

將所得各菌種接種于相同的培養(yǎng)基上反復(fù)純化，直至得到外觀、形態(tài)、顏色上一致的無雜菌污染的純種菌種。采用50%甘油水溶液置于-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存，采用內(nèi)裝有斜面固體培養(yǎng)基的試管置于4℃冰箱短期保存。

1.6 真菌DNA提取

在超凈工作臺(tái)上，挑取純化得到的真菌菌落，按試劑盒操作指南或按傳統(tǒng)提取DNA的方法進(jìn)行操作。試劑盒為Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。傳統(tǒng)方法即將菌落挑取至1.5 mL離心管中，倒入液氮研磨成粉末狀；再加入10%的chelex-100樹脂50 μL，水浴100℃加熱10 min，冷卻至室溫(25℃以下)后，12 000 r/min離心10 min，保留上清液，即含真菌DNA。

1.7 PCR擴(kuò)增

取1 μL 1.6節(jié)的上清液與12 μL Taq酶、0.5 μL ITS4引物、0.5 μL ITS1引物、11 μL ddH2O混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，34個(gè)循環(huán)后72℃充分延伸10 min。正向ITS1引物序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，反向ITS4引物序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

取1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA Marker進(jìn)行凝膠電泳，條件為電壓110 V，電流400 mA，電泳時(shí)間30 min。隨后在Omega Fluor 凝膠成像儀下觀察熒光條帶以辨別DNA是否提取成功，后將提取成功的DNA樣品送至生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.9 種屬鑒定

將測(cè)得的DNA序列用Contig Express軟件拼接并在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行BLAST比對(duì)，以序列相似度大于或等于97%確定其屬(Genus)的分類學(xué)依據(jù)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

本研究采用SPSS 17.0軟件(Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)為卡方檢驗(yàn)(X2)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

本研究采用Simpson 指數(shù)和Jaccard系數(shù)分析菌種多樣性。Simpson指數(shù)是描述生境內(nèi)物種多樣性的指標(biāo)之一，數(shù)值越大說明生境內(nèi)真菌的均衡性和豐富程度越高；Jaccard系數(shù)是比較兩個(gè)集合間相似性與差異性的指標(biāo)，數(shù)值越小說明兩集合的差異越大[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 防城港海域海泥真菌組成

選取序列相似度≥97%的菌株，并將其中相似度等于100%的菌株去除，最終共得111株不同的菌株。其中有1株葫蘆霉科Cucurbitariaceae真菌、3株子囊菌門Ascomycota真菌因未確定種屬均不納入本次分析比較。以屬作為分析的基本單位共分析107株真菌，不同屬的真菌在防城港海域海泥中的構(gòu)成差異明顯，其中優(yōu)勢(shì)菌種依次為青霉屬Penicillium39株，相對(duì)豐度36.45%；其次為枝孢屬Cladosporium21株，相對(duì)豐度19.63%；然后是曲霉屬Aspergillus11株，相對(duì)豐度10.28%。擲孢酵母屬Sporobolomyces、籃狀菌屬Talaromyces、Papiliotrema屬各4株，相對(duì)豐度均為3.74%；棒孢酵母屬Clavispora和囊擔(dān)菌屬Cystobasidium各3株，相對(duì)豐度均為2.80%；柄銹菌屬Puccinia、紅酵母屬Rhodotorula和Krasilnikovozyma屬各2株，相對(duì)豐度均為1.87%；附球菌屬Epicoccum、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、假絲酵母屬Candida、莖點(diǎn)霉屬Phoma、擬青霉屬Purpureocillium、球腔菌屬M(fèi)ycosphaerella、鐮刀菌屬Fusarium、孔韌菌屬Porostereum、Acrodontium屬、Geosmithia屬、Pezizomycotina屬和Roussoella屬各1株，相對(duì)豐度均為0.93%。

2.2 普通培養(yǎng)基的分離結(jié)果

6種普通培養(yǎng)基的分離結(jié)果如表1所示，PA普通培養(yǎng)基分離種類最少，為4屬；SA普通培養(yǎng)基中分離出的真菌種類最多，為10屬；其余4種普通培養(yǎng)基分離效果之間沒有顯著差異(P>0.05)。對(duì)比酵母菌和霉菌的分離效果，6種普通培養(yǎng)基分離得到的酵母菌最少為3屬，最多為4屬，分離效果相近；而在霉菌的分離效果上，SA普通培養(yǎng)基分離出霉菌最多為7屬，PA、CA普通培養(yǎng)基只分離出1屬，其余3種普通培養(yǎng)基分離的霉菌屬數(shù)相近，無顯著差異(P>0.05)。

表1 從6種普通培養(yǎng)基中分離得到的真菌屬數(shù)Table 1 Number of fungal genera isolated from six common media

6種普通培養(yǎng)基所分離出的真菌種數(shù)如表2所示。雖然PA普通培養(yǎng)基分離出的真菌屬數(shù)較少，但是從中分離得到的囊擔(dān)菌屬Cystobasidium真菌為41株，相比于其他的普通培養(yǎng)基具有顯著優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。YPDA普通培養(yǎng)基對(duì)枝孢屬Cladosporium真菌的分離效果較其他普通培養(yǎng)基具有顯著優(yōu)勢(shì)(P<0.05)。此外，柄銹菌屬Puccinia真菌只在PA、CA普通培養(yǎng)基分離得到，擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌也只在SA、PDA普通培養(yǎng)基中分離得到?；@狀菌屬Talaromyces、球腔菌屬M(fèi)ycosphaerella及Geosmithia屬真菌只在SA培養(yǎng)基中分離得到，Porostereum屬真菌只在YPDA普通培養(yǎng)基分離得到，莖點(diǎn)霉屬Phoma、Papiliotrema屬真菌只在PDA普通培養(yǎng)基中分離得到，假絲酵母屬Candida、Acrodontium屬及Roussoella屬真菌只在MD普通培養(yǎng)基中分離得到。說明普通培養(yǎng)基對(duì)這些屬真菌分離的選擇性較高。綜上，PDA、MD和YPDA得到的酵母數(shù)和霉菌數(shù)比較均衡，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用考慮，采用PDA、MD培養(yǎng)基進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表2 從6種普通培養(yǎng)基分離得到的真菌種數(shù)Table 2 Number of fungi species isolated from the six common media

2.3 含不同抑制劑的優(yōu)化培養(yǎng)基的分離結(jié)果

為了進(jìn)一步探討不同抑制劑對(duì)海洋真菌生長(zhǎng)的影響，本研究利用含有不同抑制劑的PDA、MD優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。從分離結(jié)果可以看出(表3)，PDA優(yōu)化培養(yǎng)基共分離得到244株霉菌，MD優(yōu)化培養(yǎng)基共分離得到141株，株數(shù)上PDA優(yōu)化培養(yǎng)基的分離效果明顯優(yōu)于MD優(yōu)化培養(yǎng)基(P<0.05)；從屬數(shù)來看，PDA優(yōu)化培養(yǎng)基共分離得到4屬霉菌，而MD優(yōu)化培養(yǎng)基共分離得到8屬霉菌。在PDA優(yōu)化培養(yǎng)基中，分離霉菌株數(shù)最多的前4位依次為含鏈霉素的優(yōu)化培養(yǎng)基(63株)>含鏈+慶的優(yōu)化培養(yǎng)基(57株)>含鏈+氯的優(yōu)化培養(yǎng)基(46株)>含氯霉素的優(yōu)化培養(yǎng)基(41株)。在MD優(yōu)化培養(yǎng)基中，分離菌株數(shù)量最多的前3位依次為含鏈+慶的優(yōu)化培養(yǎng)基(44株)>含鏈+氯的優(yōu)化培養(yǎng)基(38株)>含氯霉素的優(yōu)化培養(yǎng)基(21株)。含鏈霉素、氯霉素的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基分離效果顯著優(yōu)于分別含這兩種抑制劑的MD優(yōu)化培養(yǎng)基(P<0.05)。PDA、MD優(yōu)化培養(yǎng)基均分離得到3屬酵母菌，與2.2節(jié)的結(jié)果基本一致。

表3 優(yōu)化培養(yǎng)基的分離結(jié)果Table 3 Separation results of optimized medium

含不同抑制劑的優(yōu)化培養(yǎng)基分離得到的真菌種類如表4所示。其中分別含鏈霉素、氯霉素、鏈+慶、鏈+氯的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基及分別含鏈+慶、鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基分離得到的真菌株數(shù)較多，這6種優(yōu)化培養(yǎng)基的分離效果明顯優(yōu)于其他10種優(yōu)化培養(yǎng)基(P<0.05)。青霉屬Penicillium因?yàn)檫m應(yīng)力較強(qiáng)，所有優(yōu)化培養(yǎng)基均可分離得到；其次為枝孢菌屬Cladosporium及曲霉屬Aspergillus，含孟加拉紅的MD優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)分離枝孢菌屬稍有優(yōu)勢(shì)，含孟加拉紅的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)分離曲霉屬稍有優(yōu)勢(shì)。另外，含青+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)分離籃狀菌屬Talaromyces具有顯著優(yōu)勢(shì)(P<0.05)；囊擔(dān)菌屬Cystobasidium、擬青霉屬Purpureocillium、柄銹菌屬Puccinia以及Krasilnikovozyma屬只在含青霉素的MD優(yōu)化培養(yǎng)基中分離得到；鐮刀菌屬Fusarium真菌只在含青+慶的MD優(yōu)化培養(yǎng)基中分離得到；棒孢酵母屬Clavispora僅在含鏈+慶的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基中分離得到；擲孢酵母屬Sporobolomyces僅在含青+氯的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基中分離得到。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基所分離得到的真菌屬及種數(shù)Table 4 The genera and species number of fungi isolated from optimized medium

2.4 多樣性分析

從表5中可以看出，SA、MD普通培養(yǎng)基具有良好的均衡性與多樣性(Simpson指數(shù)>0.8)，PA普通培養(yǎng)基的Simpson指數(shù)明顯低于其他5種普通培養(yǎng)基，原因是PA普通培養(yǎng)基對(duì)真菌的選擇性較高。在含不同抑制劑的優(yōu)化培養(yǎng)基中，含青霉素、孟加拉紅的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基以及含青霉素、青+慶、青+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基均衡性較好(Simpson指數(shù)70.6)，多樣性與豐富性也較高；含氯霉素、鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基與含鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基Simpson 指數(shù)偏低(<0.2)，說明這些優(yōu)化培養(yǎng)基具有明顯的選擇性，適用于培養(yǎng)與分離特定種屬的真菌。

表5 普通培養(yǎng)基及優(yōu)化培養(yǎng)基的Simpson指數(shù)Table 5 Simpson index of common medium and optimized medium

另外，雖然MD、PDA普通培養(yǎng)基具有良好的均衡性和多樣性，但是在加入抑制劑后，其Simpson指數(shù)均有不同程度的降低。其中，分別含青霉素、孟加拉紅的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基及分別含青霉素、青+慶、青+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基，Simpson指數(shù)與其普通培養(yǎng)基相近，但分別含鏈霉素、氯霉素、鏈+慶、鏈+氯的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基，及分別含鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基Simpson指數(shù)降幅較大，顯示出與普通培養(yǎng)基截然不同的選擇性。

從表6-表8可以看出，普通培養(yǎng)基的Jaccard系數(shù)為0.222-0.600，說明它們的分離效果相似度較低，集合內(nèi)異質(zhì)性較高。而優(yōu)化培養(yǎng)基的Jaccard系數(shù)為0.111-1.000，范圍跨度較大。其中，含孟加拉紅的MD優(yōu)化培養(yǎng)基與含鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基之間Jaccard系數(shù)為1.000，說明這兩種培養(yǎng)基的分離差異性極小。但對(duì)比表5可知，二者Simpson指數(shù)差異較大，含鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)青霉屬真菌的選擇性遠(yuǎn)高于含孟加拉的MD優(yōu)化培養(yǎng)基。

表6 普通培養(yǎng)基的JaccardTable 6 Jaccard index of common medium

表7 PDA優(yōu)化培養(yǎng)基的Jaccard系數(shù)Table 7 Jaccard index of optimized PDA medium

表8 MD優(yōu)化培養(yǎng)基的Jaccard系數(shù)Table 8 Jaccard index of optimized MD medium

3 討論

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于不同培養(yǎng)基和不同抑制劑對(duì)海洋微生物分離效果的研究報(bào)道尚少，不同培養(yǎng)基由于成分不同，對(duì)真菌分離效果的均衡性與選擇性具有一定差異。目前學(xué)界普遍認(rèn)為，抗生素作為抑制劑可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)真菌生長(zhǎng)及分離一般沒有顯著影響。但是本研究發(fā)現(xiàn)，加入不同抑制劑的培養(yǎng)基之間及其與原培養(yǎng)基之間，對(duì)同一份樣品的真菌分離效果相差甚遠(yuǎn)，說明選擇合理的抑制劑有助于快速分離目標(biāo)海洋真菌。

本研究所得優(yōu)勢(shì)菌屬與多地已有報(bào)道的海洋真菌構(gòu)成相似[14]。6種普通培養(yǎng)基中，SA培養(yǎng)基分離得到的菌株種數(shù)最多，PA普通培養(yǎng)基所得菌株最少，Simpson指數(shù)分析結(jié)果與這一情況相符。PA普通培養(yǎng)基和YPDA普通培養(yǎng)基對(duì)菌株的分離效果表現(xiàn)出明顯的選擇性，其余4種普通培養(yǎng)基的Simpson指數(shù)較為接近；其中，MD普通培養(yǎng)基多樣性與均衡性較高，與文獻(xiàn)[12]結(jié)果相似。但在優(yōu)化培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含抑制劑的MD優(yōu)化培養(yǎng)基Simpson指數(shù)均有所下降且程度不一，說明抑制劑在抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí)可能也會(huì)對(duì)真菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用，但目前并沒有明確研究表明其影響機(jī)制、程度及范圍。其中，分別含青霉素、青+慶的MD優(yōu)化培養(yǎng)基的均衡性相對(duì)較高，與MD普通培養(yǎng)基的Simpson指數(shù)較為接近。其余優(yōu)化培養(yǎng)基的Simpson指數(shù)均小于0.7，而且分別含鏈霉素、氯霉素、鏈+氯的PDA優(yōu)化培養(yǎng)基與分別含鏈霉素、鏈+慶、鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基的Simpson指數(shù)小于0.1，結(jié)合表4可知這5種優(yōu)化培養(yǎng)基在分離海洋真菌時(shí)對(duì)青霉屬Penicillium具有較高的選擇性。

6種普通培養(yǎng)基之間的Jaccard系數(shù)均不超過0.6，說明任意兩種普通培養(yǎng)基分離所得的菌種組成相似度都較低。在優(yōu)化培養(yǎng)基中，MD優(yōu)化培養(yǎng)基分離的菌屬數(shù)稍多于PDA優(yōu)化培養(yǎng)基，但從PDA優(yōu)化培養(yǎng)基中分離得到的菌株數(shù)量明顯多于MD優(yōu)化培養(yǎng)基，產(chǎn)生該數(shù)量差異的主要原因是PDA培養(yǎng)基對(duì)青霉屬真菌具有較高的選擇性，這與文獻(xiàn)[9]的報(bào)道一致。但是PDA培養(yǎng)基的這種選擇性在6種普通培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)中并沒有充分表現(xiàn)，而是表現(xiàn)出對(duì)囊擔(dān)菌屬Cystobasidium的高選擇性，故推測(cè)優(yōu)化培養(yǎng)基中的8種抑制劑均可能對(duì)青霉屬真菌有抑制作用。優(yōu)化培養(yǎng)基之間的Jaccard系數(shù)數(shù)值跨度均較大。其中值得注意的是，含孟加拉紅的MD優(yōu)化培養(yǎng)基與鏈+氯的優(yōu)化MD培養(yǎng)基之間的Jaccard系數(shù)為1.000，是由于這兩種培養(yǎng)基所得真菌都為青霉屬Penicillium和枝孢菌屬Cladosporium真菌。結(jié)合Simpson指數(shù)可以看出，含孟加拉紅的MD優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)這兩種真菌的分離具有較好的均衡性，而含鏈+氯的MD優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)青霉屬Penicillium真菌具有較高的選擇性。

本研究中除分離得到111株基因序列相似度≥97%的真菌外，還發(fā)現(xiàn)了9個(gè)基因序列相似度小于97%的真菌菌株，其中5個(gè)菌株相似度小于94%。通常相似度94%被認(rèn)為是區(qū)分一個(gè)新種的最低界限，而相似度96.4%被認(rèn)為是值得區(qū)分一個(gè)新屬的界限[15]，因此小于97%則無法確定這些真菌的種屬，未被列入本文研究對(duì)象。這9個(gè)相似度小于97%的菌株將會(huì)在后續(xù)研究中根據(jù)形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育樹確定其歸類。

本研究分離得到青霉屬真菌7種，包括托姆青霉Penicilliumthomii、橘青霉P.citrinum、草酸青霉P.oxalicum、爪哇青霉P.javanicum、產(chǎn)紫青霉P.purpurogenum、簡(jiǎn)青霉P.simplicissimum、菌核青霉P.sclerotiorum；枝孢菌屬真菌7種，包括黃色枝孢菌Cladosporiumxanthochromaticum、狹枝孢菌C.tenuissimum、芽枝狀枝孢菌C.cladosporioides、澳洲枝孢菌C.australiense、尖孢枝孢菌C.oxysporum、C.Perangustum、C.anthropophilum等，這兩屬真菌具有廣泛的藥用前景，包括抗癌[16,17]、抗菌[18]、抗氧化[19]以及合成藥用活性化合物的關(guān)鍵前體[20,21]。本研究結(jié)果有助于建立北部灣海域真菌樣品庫(kù)，為后續(xù)海洋真菌代謝產(chǎn)物分離、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為高效地提取分離海洋真菌提供有價(jià)值的參考。