王 玲,孟偉民

(1青海省第四人民醫(yī)院呼吸五科,西寧 810000;2青海省第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

結(jié)核病是人類三大傳染性疾病之一,結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)是引起結(jié)核病的病原菌,可侵犯全身各器官,以肺結(jié)核最為常見[1]。巨噬細(xì)胞是人體免疫細(xì)胞,是Mtb侵入機(jī)體的主要靶細(xì)胞,在Mtb感染宿主時(shí),其可以通過吞噬作用、自噬、凋亡等機(jī)制對(duì)細(xì)胞內(nèi)Mtb進(jìn)行清除[2]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)在免疫反應(yīng)和免疫逃逸中有重要作用,廣泛分布于人體各種細(xì)胞表面[3]。機(jī)體在感染Mtb之后,巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞上的TLRs能夠特異性識(shí)別Mtb上的病原體相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular pattern,PAMP),促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)[4]。TLR4能夠通過激活髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 8,MyD88)依賴性通路和MyD88非依賴通路在Mtb感染巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用[5]。miRNA與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等過程有關(guān),多個(gè)研究表明miRNA通過調(diào)控TLR4通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗Mtb感染過程[6-8]。TLR4是miR-20a的一個(gè)下游靶基因[9],對(duì)miR-20a靶向調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞抗Mtb感染的作用還不清楚。因此本研究通過檢測巨噬細(xì)胞感染Mtb后miR-20a的表達(dá),分析miR-20a靶向TLR4通路在巨噬細(xì)胞抗Mtb過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

THP-1人單核細(xì)胞株(SCSP-567),購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫;H37Ra Mtb菌種,購自于美國BD公司;佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)(貨號(hào):P8139)購自于美國Sigma公司;Lipofectamine 3000試劑盒(貨號(hào):L3000008),購自美國Invitrogen公司;RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(貨號(hào):9108Q、RR037、RR820Q),購自日本TAKARA公司;胎牛血清、青霉素-鏈霉素、RPMI-1640培養(yǎng)基、消化胰酶(貨號(hào):10099,15070063,61870036,25200056)購自美國Gibco公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(貨號(hào):KFS303),購自北京百奧萊博科技有限公司;Bcl-2、Bim、TLR4、MyD88、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、p-MAPK、β-actin單抗(貨號(hào):4223,2933,14358,4283,4696,4370,8457),購自美國Cell Signaling Technology公司;Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡雙染試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào):A0208、P0033、P0012、C1062),購自南通碧云天生物技術(shù)公司;mi20a、U6、miR-20a mimics、miR-20a mimics-negative control,生工生物工程(上海)股份有限公司合成;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀,購自美國ABI公司;Nanodrop 2000、酶標(biāo)儀、蛋白凝膠成像儀,購自美國Thermo Fisher公司;流式細(xì)胞儀,購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人源性單核細(xì)胞株THP-1培養(yǎng) 取1 ml凍存THP-1細(xì)胞37 ℃水浴中快速解凍,轉(zhuǎn)移至離心管中,并加入9 ml RPMI-1640培養(yǎng)基,吸打混勻,1 000 r/min離心5 min,棄上清,轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.2.2 THP-1源性巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 將1.2.1中對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種至6孔板中,并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為6×105個(gè)/孔,100 ng/ml PMA處理THP-1單核細(xì)胞24 h,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)由單個(gè)圓形懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁、形態(tài)不規(guī)則的貼壁細(xì)胞,THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞THP-1。

1.2.3 Mtb感染巨噬細(xì)胞THP-1 感染前1 d,將1.2.2中巨噬細(xì)胞THP-1接種至24孔板,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/孔。細(xì)胞分為未感染組(n=3)和感染組(n=3),按照感染復(fù)數(shù)MOI=10的H37Ra Mtb感染巨噬細(xì)胞THP-1,培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入1 ml新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),分別在感染0,6,12,24 h后,檢測各組miR-20a的表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取1.2.3中生長至對(duì)數(shù)期的感染組巨噬細(xì)胞THP-1,0.25%胰蛋白酶消化,接種至6孔板中,調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個(gè)/孔,細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí),更換為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。利用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,操作嚴(yán)格按照試劑說明書。轉(zhuǎn)染后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,并分為感染組(只含有THP-1細(xì)胞),陰性轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L的miR-20a mimics-NC),miR-20a mimics組(轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L的miR-20a mimics序列);另外選取未感染巨噬細(xì)胞THP-1作為未感染組。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取1.2.4中各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,每孔100 μl加至96孔板中,每組設(shè)置6個(gè)重復(fù),設(shè)置空白組僅添加細(xì)胞培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后,加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃避光培養(yǎng)2 h,棄上清,酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測每孔吸光度OD值,計(jì)算細(xì)胞活力(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(未感染組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取1.2.4中各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),吸取200 μl細(xì)胞懸液至離心管中,預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2次,加入5 μl FITC-Annexin Ⅴ,輕混均勻,遮光孵育15 min;加入PI染液,輕混均勻,流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測細(xì)胞中miR-20a的表達(dá) 按照RNAiso Plus說明書對(duì)1.2.3中不同時(shí)間MOI=10細(xì)胞及1.2.4各組細(xì)胞中RNA進(jìn)行提取,分光光度計(jì)測定RNA濃度,按照試劑盒說明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA,之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 30 s,退火60 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 30 s,共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組巨噬細(xì)胞THP-1中miR-20a相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列

1.2.8 載體構(gòu)建 Starbase數(shù)據(jù)庫顯示人TLR4基因3′UTR含與miR-20a的結(jié)合位點(diǎn),對(duì)含結(jié)合位點(diǎn)TLR4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,連接到PGEM-T載體上,測序篩選;酶切并連至pGL4熒光素酶報(bào)告載體,構(gòu)建pGL4-TLR4-3′UTR-WT質(zhì)粒;以此質(zhì)粒對(duì)模板進(jìn)行定點(diǎn)缺失(Del:chr9 120477327-120477332位點(diǎn))突變,測序確定突變成功,構(gòu)建pGL4-TLR4-3′UTR-Del質(zhì)粒。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析 測序驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒pGL4-TLR4-3′UTR-WT、pGL4-TLR4-3′UTR-Del和miR-20a mimics-NC、miR-20a mimics分別共轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞THP-1中,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),轉(zhuǎn)染6 h后,更換培養(yǎng)基。質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36 h后,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌細(xì)胞;每孔加入50 μl的1×PLB,震蕩使細(xì)胞全部裂解;不透光96孔酶標(biāo)板中每孔加上述上清液10 μl,加入100 μl雙熒光素酶反應(yīng)試劑Ⅱ,檢測熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度,記為A;測定結(jié)束后加100 μl Stop&Glo,檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度,記為B。A/B數(shù)值為熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.10 蛋白免疫印跡(Western blot,WB)法檢測蛋白表達(dá) 取1.2.4中各組細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后調(diào)整濃度為5×105個(gè)/ml,每孔100 μl加至96孔板中,棄上清,PBS洗滌2次,重懸細(xì)胞,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒測定總蛋白濃度,蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉遮光封閉2 h;分別加入一抗稀釋液(Bcl-2、Bim、TLR4、MyD88、p-MAPK、MAPK、β-actin),均為1 ∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗稀釋液(1 ∶2 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Mtb感染巨噬細(xì)胞THP-1后miR-20a的表達(dá)

與未感染組比較,Mtb感染組巨噬細(xì)胞THP-1中miR-20a表達(dá)顯著降低,且隨著感染時(shí)間的增加,miR-20a表達(dá)顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 Mtb感染巨噬細(xì)胞THP-1后miR-20a的表達(dá)

2.2 轉(zhuǎn)染效果檢測

與未感染組比較,感染組miR-20a表達(dá)顯著降低;與感染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,miR-20a mimics組細(xì)胞miR-20a表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

與未感染組比較,aP<0.05;與感染組比較,bP<0.05;與陰性轉(zhuǎn)染組比較,cP<0.05圖1 轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后巨噬細(xì)胞THP-1中miR-20a表達(dá)Figure 1 Expression of miR-20a in macrophages THP-1 after transfection with miR-20a mimics

2.3 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

與未感染組比較,感染組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05);與感染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,miR-20a mimics組細(xì)胞活力顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

2.4 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響

與未感染組比較,感染組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與感染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,miR-20a mimics組細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3,4)。

2.5 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞Bcl-2、Bim蛋白表達(dá)的影響

與未感染組比較,感染組細(xì)胞蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低,Bim蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與感染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,miR-20a mimics組細(xì)胞蛋白Bcl-2表達(dá)顯著升高,Bim蛋白表達(dá)顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3,圖5)。

與未感染組比較,aP<0.05;與感染組比較,bP<0.05;與陰性轉(zhuǎn)染組比較,cP<0.05圖2 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響Figure 2 The effect of miR-20a on cell viability of macrophages

與未感染組比較,aP<0.05;與感染組比較,bP<0.05;與陰性轉(zhuǎn)染組比較,cP<0.05圖3 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 The effect of miR-20a on apoptosis of macrophages

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 The effect of miR-20a on apoptosis of macrophages by flow cytometry

表3 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞中Bcl-2、Bim蛋白表達(dá)的影響

圖5 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞Bcl-2、Bim蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of miR-20a on Bcl-2, Bim protein expression in macrophages

2.6 miR-20a靶向調(diào)控TLR4基因的關(guān)系驗(yàn)證

Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明,TLR4基因3′UTR區(qū)有miR-20a結(jié)合位點(diǎn),位于chr9 120477327-120477332區(qū)域(見圖6A)。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明,與NC-pGL4-TLR4-3′UTR-WT組比較,mimics-pGL4-TLR4-3′UTR-WT組熒光素酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);mimics-p-GL4-TLR4-3′UTR-Del組熒光素酶活性無顯著性變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖6B)。

2.7 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4通路蛋白表達(dá)的影響

與未感染組比較,感染組TLR4、MyD88、p-MAPK/MAPK水平顯著升高(P<0.05);與感染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,miR-20a mimics組巨噬細(xì)胞TLR4、MyD88、p-MAPK/MAPK水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖7,表4)。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TLR4是miR-20a的靶基因Figure 6 Verification of target relationship between miR-20a and TLR4 by double luciferase reporter gene experiment

圖7 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4通路蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of miR-20a on TLR4 pathway protein expression in macrophages

表4 miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體抵御細(xì)菌入侵的第一道防線,其可通過病原體的PAMP識(shí)別入侵病原體,從而啟動(dòng)抗感染的先天免疫反應(yīng)[10]。細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的過程,在傳染性疾病中,病原體誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡或抑制宿主細(xì)胞凋亡在疾病進(jìn)展中有重要作用[11]。巨噬細(xì)胞凋亡是機(jī)體抵御Mtb感染的一種防御機(jī)制,能夠抑制Mtb的生長,進(jìn)而限制Mtb在體內(nèi)的傳播[12],另一方面,Mtb又能夠通過抑制巨噬細(xì)胞的凋亡,保護(hù)宿主細(xì)胞,從而為其在胞內(nèi)生長提供有利的環(huán)境[13]。本研究結(jié)果表明Mtb感染后,巨噬細(xì)胞THP-1活性顯著低于未感染組,細(xì)胞凋亡率顯著高于未感染組,WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,與未感染組比較,感染后THP-1細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低,凋亡蛋白Bim表達(dá)顯著增加,說明Mtb感染可能會(huì)影響巨噬細(xì)胞的凋亡,影響細(xì)胞活性。

miRNA在人類傳染性疾病中有重要的作用,研究表明Mtb能夠通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá),影響細(xì)胞凋亡進(jìn)而逃避免疫應(yīng)答[14]。miR-20a屬于miR-17家族成員,多個(gè)研究表明miR-17家族成員與Mtb感染有關(guān),如Kumar等[15]研究表明Mtb感染會(huì)導(dǎo)致miR-17的下調(diào)及其靶標(biāo)Mcl-1和STAT3的上調(diào),與Mtb感染的巨噬細(xì)胞的自噬有關(guān)。Guo等[16]研究表明miR-20a過表達(dá)抑制了巨噬細(xì)胞的自噬促進(jìn)分枝桿菌的存活。本研究結(jié)果表明,感染Mtb后,巨噬細(xì)胞THP-1中miR-20a表達(dá)顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,而轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后Mtb感染的巨噬細(xì)胞THP-1凋亡率顯著降低,說明miR-20a過表達(dá)能夠抑制巨噬細(xì)胞的凋亡,從而加快病情進(jìn)展,miR-20a表達(dá)可能在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。Zhang等[17]研究表明miR-20a過表達(dá)在Mtb誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡中起負(fù)調(diào)節(jié)的作用,抑制miR-20a表達(dá)可使感染的巨噬細(xì)胞THP-1更有效清除分枝桿菌,與本研究結(jié)果一致。本研究WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明miR-20a mimics組Mtb感染的巨噬細(xì)胞THP-1抗凋亡蛋白Bcl-2水平顯著高于感染組,而凋亡蛋白Bim水平顯著低于感染組,進(jìn)一步提示miR-20a過表達(dá)抑制Mtb感染的巨噬細(xì)胞的凋亡。

本研究利用Starbase數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-20a靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn),TLR4是miR-20a的潛在靶基因。TLR4基因位于9q 32-33,屬于Ⅰ型跨膜蛋白,由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)區(qū)三部分組成,廣泛分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等各種細(xì)胞表面。TLR4能夠與Mtb相互作用,與Mtb感染后巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答有關(guān)[18,19],Wu等[10]研究表明Mtb感染后巨噬細(xì)胞THP-1中TLR4、MyD88表達(dá)顯著高于未感染組。本研究結(jié)果表明,miR-20a可顯著抑制野生型TLR4熒光素酶活性,TLR4基因3′UTR區(qū)與miR-20a結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變,可恢復(fù)熒光素酶活性,表明miR-30a可靶向調(diào)控TLR4基因。Chen等[20]研究表明miR-20a過表達(dá)顯著抑制人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HAEC中TLR4和MyD88的水平,miR-20a可能通過負(fù)調(diào)控TLR4通路保護(hù)HAEC免受炎癥損傷。本研究進(jìn)一步表明,與未感染比較,巨噬細(xì)胞THP-1感染Mtb感染后,其TLR4、MyD88蛋白表達(dá)顯著升高,而在轉(zhuǎn)染miR-20a mimics之后,與感染組和陰性轉(zhuǎn)染組比較,miR-20a mimics組細(xì)胞TLR4、MyD88、p-MAPK蛋白表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步說明miR-20a可能通過靶向調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞抗Mtb感染。

綜上所述,miR-20a在Mtb感染巨噬細(xì)胞THP-1中呈低表達(dá),miR-20a過表達(dá)可能通過下調(diào)TLR4信號(hào)通路促進(jìn)Mtb感染的巨噬細(xì)胞THP-1的凋亡,miR-20a低表達(dá)可能是Mtb清除的潛在機(jī)制。本研究僅測定了巨噬細(xì)胞THP-1中miR-20a、TLR4通路蛋白的表達(dá),而對(duì)miR-20a靶向TLR-4的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。