張雨凝, 張蕊, 楊鎮(zhèn)偉, 杜鑫, 王立強(qiáng)

(1. 華僑大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 深圳聯(lián)創(chuàng)立達(dá)環(huán)境技術(shù)有限公司， 廣東 深圳 518116)

殺菌消毒是預(yù)防病毒傳播流行的一項(xiàng)非常重要的措施.目前普遍使用的消毒產(chǎn)品主要有含氯消毒劑、醇類(lèi)消毒劑、含碘消毒劑和過(guò)氧化物類(lèi)消毒劑幾大類(lèi)[1].但是，高濃度含氯消毒劑具有腐蝕性和刺激性，會(huì)對(duì)人體和生態(tài)環(huán)境造成危害；醇類(lèi)消毒劑(乙醇、異丙醇等)由于其較強(qiáng)的氧化、脂溶作用，長(zhǎng)期用于手和皮膚消毒后，易使人們產(chǎn)生過(guò)敏性皮炎、失水、干裂痛感；過(guò)氧化物類(lèi)消毒劑(過(guò)氧乙酸、雙氧水等)雖然殺滅效果好，但其性質(zhì)不穩(wěn)定，容易分解，在運(yùn)輸和儲(chǔ)存的過(guò)程中易發(fā)生爆炸.隨著人們消毒預(yù)防意識(shí)的提高，研制一種安全、高效、環(huán)保的消毒劑成為當(dāng)務(wù)之急.

近年來(lái)，中藥消毒劑在消毒學(xué)領(lǐng)域取得新進(jìn)展，將中藥應(yīng)用于消毒劑不僅開(kāi)辟了中藥藥源，還擴(kuò)大了中藥的使用范圍.中藥消毒劑取材天然，安全無(wú)毒，氣味芳香.某些中藥成分具有多靶點(diǎn)及顯著的體外抗病毒、抗菌效果，可有效抑制病源復(fù)制、阻斷病源傳播[2]，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，并由于組方中的多元成分協(xié)同作用，不易產(chǎn)生耐藥性.復(fù)方季銨鹽類(lèi)消毒劑具有毒性低、抑菌溫和、抑菌譜廣的特點(diǎn)[3]，但也存在不足，如毒性蓄積、對(duì)部分微生物殺滅效果不理想等，在一定程度上限制了此類(lèi)消毒劑的應(yīng)用.為獲得廣譜、安全、高效的消毒劑，中西藥復(fù)配消毒劑已成為新的研究熱點(diǎn).有研究表明，將中藥提取液與季銨鹽類(lèi)消毒劑復(fù)配[4-5]，既可彌補(bǔ)單一使用中藥消毒劑起效慢、殺滅效率低的不足，又可降低單用季銨鹽消毒劑的腐蝕性、難降解性和不良反應(yīng)率，從而實(shí)現(xiàn)減毒增效且環(huán)保的完美效果.基于此，本文研究一種以復(fù)方中藥提取物為主、季銨鹽類(lèi)衍生復(fù)合物為輔的復(fù)配消毒抑菌劑的消毒抑菌效果、毒性和穩(wěn)定性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)配消毒抑菌劑為以中藥提取物(大黃、姜黃、苦參、金銀花、藿香、黃柏和艾葉等)和季銨鹽類(lèi)衍生復(fù)合物(二甲基芐基氯化銨、十八烷基二甲基氯化銨和二癸基甲基聚丙酸銨)為主要成分的黃色澄明液體，無(wú)刺激性氣味，pH值為8.12，由國(guó)內(nèi)某公司提供.

試驗(yàn)病毒H9N2亞型禽流感病毒、HCoV-NL63病毒和試驗(yàn)菌金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌(ATCC 8099)、白色念珠菌(ATCC 6538)均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院消毒檢測(cè)中心提供.

試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)小鼠和普通級(jí)家兔，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(閩)2016-0002.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液與病毒懸液的制備 試驗(yàn)菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌，試驗(yàn)病毒為H9N2亞型禽流感病毒和HCoV-NL63病毒.依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》(下同)[6]規(guī)定的相應(yīng)方法，制備試驗(yàn)菌懸液和病毒懸液備用.

1.2.2 中和劑鑒定試驗(yàn) 試驗(yàn)菌為金黃色葡萄球菌和白色念珠菌，試驗(yàn)病毒為H9N2亞型禽流感病毒和HCoV-NL63病毒.依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》[6]規(guī)定的相應(yīng)方法，進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.3 懸液定量殺菌試驗(yàn) 試驗(yàn)菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌.取含有0.5 mL有機(jī)干擾物(體積分?jǐn)?shù)為3%的牛血清白蛋白)的1 mL菌懸液，加入4 mL不同濃度消毒劑的無(wú)菌試管中，在20 ℃水浴條件下作用至規(guī)定時(shí)間，分別在多個(gè)裝有4.5 mL中和劑的試管中加入制好的0.5 mL樣品溶液，混勻并作用10 min，取0.2 mL制好的溶液進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 病毒懸液定量試驗(yàn) 試驗(yàn)病毒為H9N2亞型禽流感病毒和HCoV-NL63病毒.將0.1 mL有機(jī)干擾物質(zhì)(體積分?jǐn)?shù)為3%的牛血清白蛋白)與0.1 mL病毒懸液混合，并在(20±1) ℃水浴中作用5 min，加入0.8 mL不同濃度的待測(cè)消毒劑，混勻后作用至規(guī)定時(shí)間后，分別取出0.1 mL溶液，通過(guò)稀釋法去除殘留消毒劑，按終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定并計(jì)算病毒滴度，用半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)表示，并計(jì)算滅活對(duì)數(shù)值，試驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5 動(dòng)物毒性試驗(yàn) 1) 選取雌性、雄性各10只的KM小鼠，體質(zhì)量為18～22 g.依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》[6]規(guī)定的相應(yīng)方法，設(shè)定5 000 mg·kg-1體質(zhì)量為一個(gè)劑量組.按每10 g體質(zhì)量的小鼠灌胃0.2 mL的劑量，試驗(yàn)組灌復(fù)配消毒抑菌劑原液，對(duì)照組灌蒸餾水,每組雌、雄各半.連續(xù)觀(guān)察小鼠14 d，記錄它們的中毒與死亡情況.2) 選取3只體質(zhì)量為2～3 kg的健康大白兔，在試驗(yàn)前24 h，用脫毛劑將大白兔背部脊柱左、右兩側(cè)的毛各去掉約3 cm×3 cm的范圍.次日，將復(fù)配消毒抑菌劑原液涂在一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂蒸餾水作為對(duì)照，在涂抹后4 h，用蒸餾水清洗，除去殘留物.每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14 d.在每次涂抹后24 h觀(guān)察結(jié)果，按照《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》[6]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分和判定受試物對(duì)完整皮膚的刺激強(qiáng)度.

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 1) 將消毒抑菌劑分成3組，分別置于棕色廣口瓶中，在-20,-10,-5,0,5 ℃的環(huán)境中放置7 d，觀(guān)察不同低溫下各組消毒抑菌劑的性狀.2) 取包裝好的消毒抑菌劑樣品，依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》[6]規(guī)定的相應(yīng)方法，將其置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中(相對(duì)濕度>75%)存放90 d后，檢測(cè)消毒抑菌劑原液對(duì)金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的殺菌效果，試驗(yàn)重復(fù)3次.

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)

復(fù)配消毒抑菌劑中和鑒定結(jié)果,如表1所示.表1中：lg TCID50為平均殺滅對(duì)數(shù)值.由表1可知：用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%的硫代硫酸鈉、1%的卵磷脂、1%的吐溫-80的磷酸鹽緩沖液(PBS)作為該復(fù)配消毒抑菌劑中和劑，可將消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌和試驗(yàn)病毒的殘留作用有效中和.中和劑與中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌、病毒、細(xì)胞株生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用，符合《消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)》的要求.

表1 復(fù)配消毒抑菌劑中和鑒定結(jié)果Tab.1 Neutralization identification results of compound disinfectant and bacteriostatic agent

2.2 懸液定量殺菌試驗(yàn)

不同作用時(shí)間下,復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)不同試驗(yàn)菌的殺滅對(duì)數(shù)值,如表2所示.表2中：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的陽(yáng)性對(duì)照組的平均菌數(shù)對(duì)數(shù)值分別為7.52，7.55，6.37.

表2 不同作用時(shí)間下復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)不同試驗(yàn)菌的平均殺滅對(duì)數(shù)值Tab.2 Average killing logarithm value of the compound disinfectant and bacteriostatic agent to different test bacteria under different action times

由表2可知：當(dāng)使用稀釋2倍的該復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)菌懸液作用2 min及以上或使用該復(fù)配消毒抑菌劑原液作用1 min及以上時(shí)，懸液內(nèi)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的平均殺滅對(duì)數(shù)值均大于5，懸液內(nèi)的白色念珠菌的平均殺滅對(duì)數(shù)值均大于4，表明使用該復(fù)配消毒抑菌劑原液作用1 min即可將這3種病菌完全殺滅.

2.3 病毒懸液定量試驗(yàn)

不同作用時(shí)間下，復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)HCoV-NL63病毒和H9N2亞型禽流感病毒的平均滅活對(duì)數(shù)值,如表3所示.表3中：HCoV-NL63病毒和H9N2亞型禽流感病毒的陽(yáng)性對(duì)照組平均滅活對(duì)數(shù)值分別為6.32，5.83.

表3 不同作用時(shí)間下復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)HCoV-NL63病毒和H9N2亞型禽流感病毒的平均滅活對(duì)數(shù)值Tab.3 Average inactivation logarithm value of HCoV-NL63 virus and H9N2 subtype avian influenza virus with the compound disinfectant antibacterial agent under different action times

由表3可知：當(dāng)復(fù)配消毒抑菌劑原液對(duì)病毒懸液作用2 min及以上時(shí)，HCoV-NL63病毒和H9N2亞型禽流感病毒的平均滅活對(duì)數(shù)值均大于5，表明使用該消毒劑原液作用2 min及以上即可將這兩種病毒完全滅活.

2.4 動(dòng)物毒性試驗(yàn)

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)20只小鼠按10 g體質(zhì)量分別灌胃0.2 mL劑量的復(fù)配消毒抑菌劑(受試組)和蒸餾水(正常對(duì)照組)，每組各10只,觀(guān)察14 d后，受試小鼠無(wú)死亡，經(jīng)口半數(shù)致死量(LD50)均大于5 000 mg·kg-1.處死小鼠后，解剖尸體，并對(duì)組織器官進(jìn)行觀(guān)察，正常對(duì)照組和受試組小鼠的肝、腎、腸組織的病理學(xué)特征，如圖1～3所示.由圖1～3可知:小鼠的肝、腎、腸組織內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)病理改變，表明該復(fù)配消毒抑菌劑屬于實(shí)際無(wú)毒[6].

(a) 正常對(duì)照組 (b) 受試組 圖1 小鼠的肝組織病理學(xué)特征Fig.1 Histopathological features of liver in mice

(a) 正常對(duì)照組 (b) 受試組 圖2 小鼠腎組織病理學(xué)特征Fig.2 Histopathological features of kidney in mice

(a) 正常對(duì)照組 (b) 受試組 圖3 小鼠腸組織病理學(xué)特征Fig.3 Histopathological features of intestine in mice

3只健康大白兔多次皮膚刺激試驗(yàn)均未出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫現(xiàn)象，判斷該復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)大白兔的皮膚刺激反應(yīng)平均指數(shù)為0，刺激強(qiáng)度均屬無(wú)刺激性.

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

復(fù)配消毒抑菌劑的低溫抗凍性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，如表4，5所示.表5中：t為存放時(shí)間.由表4,5可知：在不同低溫下放置7 d后，該配消毒抑菌劑性狀仍保持澄清透明；在37 ℃放置90 d后，用復(fù)配消毒抑菌劑原液對(duì)金黃色葡萄球菌作用1 min的平均殺滅對(duì)數(shù)值大于5，對(duì)白色念珠菌作用1 min的平均殺滅對(duì)數(shù)值大于4，表明該復(fù)配消毒抑菌劑的低溫抗凍性及穩(wěn)定性較好，可持續(xù)有效作用2 a[6].

表4 復(fù)配消毒抑菌劑的低溫抗凍性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Test results of low temperature frost resistance of compound disinfectant and bacteriostatic agent

表5 復(fù)配消毒抑菌劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Stability test results of compound disinfectant and bacteriostatic agent

3 討論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，大黃[7-8]、姜黃[9-10]、苦參[11-13]、黃柏[14-15]、金銀花[16-18]、艾葉[19-21]、藿香[22-25]等中藥提取物對(duì)肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌等多種病菌都表現(xiàn)出較好的抗菌活性，且都具有廣譜抗病毒活性，可達(dá)到殺滅病毒而不影響宿主細(xì)胞的目的，其不僅是治療病毒性疾病的理想藥物，還是環(huán)保的體外消毒藥物.將中藥用于消毒劑的研發(fā)，開(kāi)拓了中藥藥源，擴(kuò)大了中藥的使用范圍，降低了使用傳統(tǒng)消毒劑對(duì)環(huán)境帶來(lái)的污染和對(duì)人體產(chǎn)生的毒副作用，是消毒劑發(fā)展的新趨勢(shì).有研究表明，將中藥與季銨鹽類(lèi)消毒劑配伍可提高消毒劑的消毒效果與穩(wěn)定性, 且中藥殘?jiān)鼘?duì)中藥季銨鹽復(fù)合消毒劑的殺菌效果無(wú)明顯影響[26].

季銨鹽類(lèi)表面活性劑發(fā)展至今已衍生了七代產(chǎn)品[27]，其消毒機(jī)理為提高細(xì)胞膜通透性，使胞質(zhì)外漏，或者使蛋白酶變性，對(duì)細(xì)菌繁殖體的殺滅效果好[28].同時(shí)，它還能特異性殺滅冠狀病毒，這可能與其可破壞冠狀病毒外層的生物膜結(jié)構(gòu)有關(guān)[29].有研究表明，傳統(tǒng)與新型季銨鹽及其他殺菌劑的復(fù)配可協(xié)同殺菌、持續(xù)殺菌，提高殺菌效果，降低腐蝕性[30].因此，復(fù)配消毒抑菌劑中的季銨鹽衍生復(fù)合物可達(dá)到殺滅微生物與冠狀病毒的目的.

GB 26369-2010《季銨鹽類(lèi)消毒劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)季銨鹽消毒劑限定了有效成分季銨鹽的使用含量，規(guī)定用于手與皮膚的消毒劑不得超過(guò)5 000 mg·L-1, 用于黏膜的消毒劑不得超過(guò)2 000 mg·L-1[31].但是市售的季銨鹽消毒劑為了使其消毒效果達(dá)到最佳，往往會(huì)提高季銨鹽的含量，這不僅會(huì)局限消毒劑的應(yīng)用范圍，還會(huì)加重對(duì)人體的刺激性.文中所用的復(fù)配消毒抑菌劑以復(fù)方中藥提取物為主要成分，加入少量季銨鹽衍生復(fù)合物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)少于0.1%)，規(guī)避了市面上季銨鹽使用含量過(guò)多而造成對(duì)人體皮膚和呼吸道刺激嚴(yán)重的問(wèn)題，擴(kuò)大了使用范圍，安全環(huán)保、消殺迅速、溫和持久.

試驗(yàn)結(jié)果顯示，該消毒抑菌劑原液對(duì)懸液內(nèi)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、HCoV-NL63病毒和H9N2亞型禽流感病毒均有較好的消殺效果.試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該消毒抑菌劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的殺滅效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌和真菌，且稀釋倍數(shù)越大，對(duì)病菌的殺滅效果越差，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺滅效果越好，這可能與季銨鹽衍生復(fù)合物的殺菌機(jī)理有關(guān).其次，該消毒抑菌劑對(duì)病菌的殺滅效果優(yōu)于對(duì)病毒的滅活效果，原因可能與中藥的作用有關(guān)，中藥雖然具有多靶點(diǎn)，但是其抗病毒的效果較化學(xué)藥緩慢、持久、溫和，需要用高濃度中藥消毒劑才能達(dá)到有效滅活病毒的效果.因此，使用本研究的復(fù)配消毒抑菌劑進(jìn)行消毒時(shí)，建議使用原液進(jìn)行消毒或適當(dāng)延長(zhǎng)消毒時(shí)間以達(dá)到預(yù)期的消毒效果.

研究所用復(fù)配消毒抑菌劑對(duì)細(xì)菌繁殖體和真菌及試驗(yàn)病毒(包括冠狀病毒)表現(xiàn)出較強(qiáng)的消殺效果，但是對(duì)于能否針對(duì)性地殺滅COVID-19，還有待進(jìn)一步的研究.試驗(yàn)結(jié)果表明，該消毒抑菌劑質(zhì)量穩(wěn)定，可在相對(duì)寒冷地區(qū)使用，殺滅效果持久，有效期可達(dá)2 a.然而，光照和氧是否會(huì)對(duì)消毒抑菌劑的消毒效果產(chǎn)生影響還有待考察.毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該消毒抑菌劑未發(fā)現(xiàn)急性經(jīng)口毒性，屬實(shí)際無(wú)毒類(lèi)，對(duì)皮膚無(wú)刺激，可用于人體皮膚及粘膜的消毒.研究未對(duì)單用中藥提取物和季銨鹽衍生復(fù)合物的消毒效果進(jìn)行試驗(yàn)，無(wú)法判斷兩者的消毒效果是否具有協(xié)同作用，因此，還應(yīng)對(duì)其做進(jìn)一步的研究.