馬聞擎，李欣然，謝嘉欣，王袁，楊雨濤，付霞霏

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510282

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是一種較為常見的女性生殖內(nèi)分泌疾病，是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常、促性腺激素水平升高及雌激素水平波動性下降[1-2]。POI的病因具有高度異質(zhì)性，目前已知的病因包括遺傳、免疫、醫(yī)源性因素(手術(shù)、放化療)、代謝異常及感染等，但部分患者病因尚不明確[3]。POI患者中5%～30%伴有自身免疫性疾病，包括自身免疫性甲狀腺炎、1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[4]。此類免疫性POI(autoimmune POI，aPOI)尚無明確的診斷標準，目前臨床上主要通過檢測血清中的自身抗體以及是否伴發(fā)其他自身免疫性疾病進行診斷[5]。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控，因其在體液中具有良好的穩(wěn)定性，有望成為一類非侵入性的診斷標志物應(yīng)用于臨床[6-8]。miR-21是卵巢組織中含量較豐富的miRNA之一，通過調(diào)控其靶基因第10染色體同源丟失磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)、程序性細胞死亡-4基因(PDCD4)、原肌球蛋白-1基因(TPM1)等在細胞分化、細胞周期及細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[9-10]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可減少卵巢顆粒細胞的凋亡，緩解化療藥物造成的POI[11]。為了進一步探究miR-21在aPOI中的作用，本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出miR-21下游一種免疫相關(guān)的靶基因Pellino-1(Peli1)。Peli1是一種新近發(fā)現(xiàn)的多泛素連接酶，具有抑制T細胞活化、介導(dǎo)免疫耐受的作用，同時也可影響細胞凋亡過程[12-13]。本研究通過測定aPOI患者miR-21及Peli1的表達水平，探討了二者對aPOI的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院2018年4月－2019年10月未經(jīng)治療的初診為aPOI的患者26例作為aPOI組，30名健康女性作為對照組。aPOI診斷標準：發(fā)病年齡＜40歲，間隔4周以上進行兩次檢測血清基礎(chǔ)促卵泡激素(FSH)均＞25 U/L，同時伴有自身免疫性疾病和(或)自身抗體陽性。對照組納入標準：18～40歲健康青年女性，月經(jīng)周期規(guī)律(28～35 d)，月經(jīng)第3天測定血清性激素[雌二醇(E2)、FSH、促黃體生成素(LH)]及抗苗勒管激素(AMH)水平正常，自身免疫指標陰性。排除標準：曾有激素補充治療、免疫抑制治療、卵巢手術(shù)史、放化療史的女性；曾有血栓栓塞史、嚴重高血壓、嚴重肥胖、肝腎功能不全、卵巢異常及已知核型異常的女性。簽署知情同意書后，采集兩組病史，記錄以下一般資料：年齡、體重指數(shù)(BMI)、初潮年齡、經(jīng)期、月經(jīng)周期、更年期癥狀(包括月經(jīng)紊亂、潮熱、心悸、頭痛、頭暈、失眠、耳鳴、注意力不集中、情緒波動、記憶力減退，并記錄陽性數(shù)量)、孕產(chǎn)史。本研究嚴格遵照赫爾辛基宣言進行，已通過南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理審查委員會審查。

1.2 外周血采集及保存 aPOI組在診斷當天、對照組在月經(jīng)第3天行外周靜脈穿刺采血；留取5 ml外周血，在4 ℃條件下3000 r/min離心10 min，分離血清并于-20 ℃保存?zhèn)溆?。為獲取PBMC，使用紅細胞裂解液(購自Cedarlane，Ontario，Canada)按照標準流程移除紅細胞，然后在室溫下12 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗滌2次；臺盼藍染色后于顯微鏡下觀察PBMC計數(shù)及活力。

1.3 激素及免疫指標的檢測 各項激素及免疫相關(guān)指標由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗科進行測定。性激素(E2、FSH、LH)采用化學(xué)發(fā)光法檢測；AMH采用ELISA法檢測；甲狀腺功能[包括游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺素(TSH)]采用化學(xué)發(fā)光法檢測；免疫指標[包括抗卵巢抗體(AoAb)、抗子宮內(nèi)膜抗體(EmAb)、抗心磷脂抗體(ACL)、抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體(ds-DNA)、抗著絲點抗體(ACA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白E(IgE)、補體C3(C3)、補體C4(C4)]采用ELISA法測定，并記錄陽性指標數(shù)量。

1.4 超聲檢查 于外周血采集當日由同一位檢查者行經(jīng)腹和經(jīng)陰道超聲檢查，記錄子宮大小、卵巢大小及內(nèi)膜厚度。使用Acuson 128 XP10彩色多普勒超聲診斷儀(Mountain View，CA)分別測量子宮縱向及橫向最大徑線、前后徑，以及子宮內(nèi)膜厚度(取子宮內(nèi)膜與肌層回聲界面之間的最大值)。同時記錄雙側(cè)卵巢的3個徑線，分別計算體積后取雙側(cè)卵巢體積平均值記為該患者的卵巢體積。子宮及卵巢體積均采用簡化的長橢球體積公式(縱向最大徑線×橫向最大徑線×前后徑/2)進行計算。

1.5 實時定量PCR檢測 將Trizol(Invitrogen，USA)分別加入血清標本及PBMC標本，提取總RNA 2 μg，加入cDNA合成試劑盒(Promega，Madison，USA)合成cDNA。血清miR-21及PBMC Peli1 mRNA定量分析分別采用Cel-mirR-39 mimics、GAPDH作為內(nèi)參照。引物由廣州燁善生物科技有限公司合成，引物序列見表1。使用ABI PRISM? 7500序列檢測系統(tǒng)進行qRT-PCR。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 60 s退火，共40個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。所有實驗步驟重復(fù)3次。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primers used for qRT-PCR

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布則兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例(%)表示，計數(shù)資料及不符合正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)秩和檢驗(Mann-Whitney檢驗)；兩變量間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 兩組年齡、BMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，aPOI組初潮年齡更早，經(jīng)期更短，孕次、產(chǎn)次更少，而月經(jīng)周期更長，更年期癥狀陽性數(shù)量更多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表2 兩組一般情況比較Tab.2 General characteristics and menstrual condition of patients in both groups

2.2 激素、免疫指標比較 aPOI組E2、AMH水平明顯低于對照組(P＜0.05)，F(xiàn)SH、LH、免疫指標陽性數(shù)量明顯高于對照組(P＜0.05)，但甲狀腺功能指標FT3、FT4、TSH差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

2.3 超聲檢查指標比較 超聲檢查結(jié)果顯示，對照組可見竇卵泡聲像，而aPOI組均未見卵泡聲像(圖1)。aPOI組子宮體積為(25.12±15.75) cm3，卵巢體積為(3.05±1.87) cm3，均明顯小于對照組[分別為(42.54±14.25) cm3、(7.20±2.28) cm3，P＜0.001]；aPOI組內(nèi)膜厚度[(4.53±2.51) mm]與對照組[(5.72±2.06) mm]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.057)。

表3 兩組激素及免疫指標比較Tab.3 Hormone levels and immune parameters of patients in both groups

2.4 血清miR-21及PBMC Peli1 mRNA表達水平比較 aPOI組血清miR-21及PBMC Peli1 mRNA表達水平(分別為0.60±0.14、0.30±0.14)均明顯低于對照組(分別為1.01±0.07、1.63±0.54，P＜0.001)。

2.5 miR-21、Peli1表達水平與其他指標的相關(guān)性分析 為了評估m(xù)iR-21與Peli1表達量之間的關(guān)聯(lián)，以及兩者在aPOI患者中的診斷價值，選取上述結(jié)果中兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異的指標，將aPOI組血清miR-21 及PBMC Peli1分別與這些指標進行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果表明，aPOI組PBMC Peli1與血清miR-21 表達水平呈正相關(guān)(r=0.719，P＜0.001)。此外，Peli1、miR-21均與E2、AMH、子宮體積、卵巢體積呈正相關(guān)，與FSH、LH、免疫指標陽性數(shù)量呈負相關(guān)(表4)。

表4 aPOI組PBMC Peli1、血清miR-21表達水平與其他指標的相關(guān)性Tab.4 Spearman correlation coefficients for PBMC Peli1 and serum miR-21 of aPOI patients

圖1 兩組超聲檢查下卵泡形成情況Fig.1 Follicles observed under ultrasonography in both groups

3 討 論

POI既往被稱為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，是婦科內(nèi)分泌方面的常見病和疑難病。據(jù)統(tǒng)計，近年我國POI發(fā)病率為1%～3%，且逐年遞增，并呈年輕化趨勢[14]。POI的病因具有異質(zhì)性，其中近30%的患者存在免疫功能異常，5%患有免疫性卵巢炎[15-16]。目前aPOI尚無明確的診斷標準，僅免疫性卵巢炎的病理學(xué)診斷較為明確，即查見卵巢組織內(nèi)大量淋巴細胞浸潤(卵泡內(nèi)膜、卵泡外膜、黃體內(nèi)可見CD4+、CD8+的T淋巴細胞及漿細胞浸潤，偶可見累及顆粒細胞層)[17]。但由于取材不便，臨床上不常采用此種方法。因此，探索一種無創(chuàng)而特異的診斷方法成為目前aPOI相關(guān)研究的熱點問題。近年來通過對aPOI發(fā)病機制、相關(guān)信號通路的研究，已篩選出部分可用于臨床診斷的血清學(xué)標志物，包括有抗透明帶抗體、類固醇細胞抗體(StCA)[18]、抗腎上腺皮質(zhì)抗體(AAA)[19]、胚胎需要的母體抗原(MATER)[20]、AIRE基因表達產(chǎn) 物[21]等。本研究通過對aPOI患者血清miR-21及PBMC Peli1表達水平的分析，探討二者的關(guān)系及其診斷價值和臨床意義。

miRNA作為一類非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控，通過轉(zhuǎn)錄抑制或降解影響靶基因表達的穩(wěn)定性。近年有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在卵巢類固醇生成、排卵、黃體發(fā)育及黃體功能等方面均可發(fā)揮作用，且因其在體液中具有良好的穩(wěn)定性，近期已成為研究非侵入性診斷標志物的熱門方向[6]。miR-21是一種較早發(fā)現(xiàn)的、廣泛存在于人類各種組織、細胞的miRNA，在卵巢中含量較為豐富，可影響卵泡的生長、分化及凋亡。現(xiàn)代研究表明，顆粒細胞的數(shù)量及質(zhì)量與POI的發(fā)病存在直接關(guān)系[12]。顆粒細胞的凋亡可誘導(dǎo)卵母細胞凋亡，使卵母細胞過多地閉鎖，卵巢儲備功能降低，進而導(dǎo)致POI。而大量研究結(jié)果均顯示，miR-21可通過凋亡、自噬等影響顆粒細胞功能。如Mase等[22]對miRNA進行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR-21可影響3種人源顆粒細胞系及原代顆粒細胞的基膜形成，進而維持其結(jié)構(gòu)完整性；Donadeu等[23]發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖過程中顆粒細胞及卵泡膜細胞高表達miR-21-5p/-3p；Tian等[24]發(fā)現(xiàn)高表達miR-21可通過與mTOR、凋亡及類固醇生成途徑相關(guān)的靶基因維持豬的發(fā)情周期；Ma等[25]發(fā)現(xiàn)miR-21-3p可通過AKT/mTOR通路抑制牛顆粒細胞自噬。本課題組既往研究結(jié)果也顯示，miR-21能夠通過抑制其靶基因PTEN及PDCD4表達，減少卵巢顆粒細胞的凋亡，部分改善卵巢結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能，緩解化療藥物造成的POI[11]。因此，miR-21及其下游靶基因在POI中的作用機制及診斷價值值得進一步探討。

為了探討miR-21在aPOI中的作用，本研究通過生物信息學(xué)的方法在miRDIP、TargetScan5.1、miRecords、miRanda數(shù)據(jù)庫中查找miR-21的靶基因并取其交集，篩選出與免疫功能相關(guān)的下游基因Peli1。Peli1是免疫耐受形成過程中一種多泛素連接酶，與多種自身免疫性疾病相關(guān)。Medvedev等[26]發(fā)現(xiàn)，Peli1是T淋巴細胞的負調(diào)節(jié)因子、髓系細胞的正調(diào)節(jié)因子，在各種免疫或炎癥調(diào)節(jié)途徑中起著關(guān)鍵作用。Qiu等[27]發(fā)現(xiàn)，miR-21-Peli1-c-Rel通路可通過抑制輔助T細胞-17中的糖酵解過程，抑制自身免疫的發(fā)生。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)，Peli1可通過非經(jīng)典NF-κB通路抑制B細胞介導(dǎo)的系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病。Yang等[29]發(fā)現(xiàn)，Peli1在TLR4/TRIF/NF-κB通路中起著促進炎性因子產(chǎn)生的作用。由此可見，Peli1能夠影響外周血中T、B細胞的活化，介導(dǎo)免疫耐受的形成，并可在NF-κB通路中促進炎性因子的產(chǎn)生，發(fā)揮促進炎癥、影響細胞存活的作用。

本研究選取miR-21及其靶基因Peli1作為研究對象，測定二者在aPOI患者中的表達情況，發(fā)現(xiàn)二者均呈低表達，且呈正相關(guān)關(guān)系。然而，如上所述，miRNA通過轉(zhuǎn)錄抑制或降解影響靶基因表達的穩(wěn)定性，因此較多研究中miRNA與其靶基因的表達呈負向調(diào)控關(guān)系。如Marquez等[30]發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝再生的早期階段，NF-κB信號通路被激活，而miR-21表達上調(diào)能夠抑制NF-κB信號通路，同時miR-21的靶基因Peli1表達下調(diào)，并為miR-21負反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號通路提供基礎(chǔ)；Luther等[13]發(fā)現(xiàn)，在間充質(zhì)干細胞(MSC)外泌體轉(zhuǎn)染心肌中上調(diào)miR-21a-5p能夠抑制促凋亡基因Peli1的表達。而本研究結(jié)果顯示，aPOI患者中miR-21與Peli1的表達水平均下降，為正向調(diào)控關(guān)系，原因可能為：aPOI既是一種婦科內(nèi)分泌疾病，也是一種自身免疫性疾病，同時與卵巢顆粒細胞、免疫細胞功能相關(guān)。miR-21主要在細胞增殖、凋亡方面發(fā)揮作用，功能較為明確；而Peli1作為一個新發(fā)現(xiàn)的分子，既能在顆粒細胞中發(fā)揮促進炎癥及凋亡的作用，同時也能在免疫細胞中發(fā)揮介導(dǎo)免疫耐受的作用。因此，對于miR-21與Peli1在aPOI中的作用機制，還須進一步在細胞及動物模型中進行定位、定量研究。

綜上所述，本研究通過測定aPOI患者血清中miR-21及PBMC中Peli1的表達水平，發(fā)現(xiàn)aPOI患者miR-21與Peli1表達水平下降，二者呈正相關(guān)關(guān)系，且均與E2、AMH、子宮及卵巢體積呈正相關(guān)，與FSH、LH、免疫指標陽性數(shù)量呈負相關(guān)。miR-21與Peli1可能參與了aPOI的發(fā)病，對aPOI的輔助診斷有一定參考價值。