郜琪臻，劉芳瑜，丁平田

(1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110001；2. 中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122；3. 沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

圖1 鹽酸坦洛新化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖Fig.1 Structural formula of tamsulosin hydrochloride

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是典型的年齡相關(guān)性男性疾病，我國老齡化社會的發(fā)展趨勢使得患病人群基數(shù)正不斷增大[1]。BPH的發(fā)病機(jī)制目前尚無確切闡述，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，可能與上皮和間質(zhì)細(xì)胞的增殖-凋亡平衡失衡有關(guān)[2]。同時(shí)，性激素水平[3]、炎性因子蓄積[4]、遺傳因素[5]也被認(rèn)為與BPH發(fā)病機(jī)制較為相關(guān)。BPH的臨床表現(xiàn)主要為：儲尿期慢性尿滯留，尿頻且夜尿更甚；排尿期排尿躊躇間斷；排尿后滴瀝不盡。另外，嚴(yán)重者會出現(xiàn)不同程度的血尿癥狀、泌尿系統(tǒng)感染、腎功能損害等癥狀，嚴(yán)重降低患者的生活幸福感，造成身體、精神雙重傷害[6～9]。長效α1受體阻滯劑可與α受體共價(jià)鍵牢固結(jié)合，長效占據(jù)結(jié)合域，藥理機(jī)制上通過有效緩解前列腺平滑肌張力改善和治療良性腺瘤性前列腺增生下尿路癥狀[10～12]。鹽酸坦洛新(C20H28N2O5S·HCl，結(jié)構(gòu)式見圖1)為白色結(jié)晶性粉末，無味，在甲醇或水中略溶。鹽酸坦洛新屬α1腎上腺素受體亞型α1A的阻斷劑，臨床上可用于治療BPH所致異常排尿癥狀，有效改善尿道、膀胱頸及前列腺部位平滑肌功能[13～15]。鹽酸坦洛新口服在胃和十二指腸快速吸收，空腹時(shí)易引起低血壓[16]。將其制備為緩釋制劑可使藥物在消化道內(nèi)均衡長時(shí)釋放，有效平衡血藥濃度，降低藥物副作用[17]。

本文擬基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立市售鹽酸坦洛新緩釋片的動物體內(nèi)含量變化檢測方法，并以比格犬為實(shí)驗(yàn)動物繪制藥動學(xué)曲線，驗(yàn)證方法的可靠性。在比格犬體內(nèi)進(jìn)行鹽酸坦洛新緩釋片的藥動學(xué)檢測有助于判斷制劑在比格犬胃腸道是否存在突釋現(xiàn)象，制劑的釋放曲線是否符合緩釋制劑特征等藥物溶出、吸收信息，可在一定程度上反映仿制藥與原研藥的藥動差異，是初步判斷制劑質(zhì)量的關(guān)鍵手段。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100液相系統(tǒng)(Agilent，USA)；API2000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Applied Biosystems，USA)；Analyst 1.4.1軟件(Applied Biosystems，USA)；LG10-2.4A離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)；YKH型渦旋混合器(江西醫(yī)療器械廠)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸坦洛新緩釋片(昆明積大制藥有限公司)；鹽酸坦洛新(tamsulosin hydrochloride，TH)、鹽酸苯海拉明(diphenhydramine hydrochloride，DH)(上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、甲酸、正己烷、二氯甲烷均為色譜純，(天津市康科德科技有限公司)；其他試劑未經(jīng)說明均為分析純。

1.3 動物

健康成年雄性比格犬6只，體重(8.5±0.5)kg，由上海新岡實(shí)驗(yàn)動物場提供，許可證號：SCXK(滬)2007-0009。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

液相色譜與質(zhì)譜參數(shù)結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)品二級全掃描質(zhì)譜結(jié)果見圖2。

鹽酸坦洛新[M+H]+m/z:409.3→228.2，內(nèi)標(biāo)鹽酸苯海拉明[M+H]+m/z：256.3→167.1。

表1 色譜條件

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品二級全掃描質(zhì)譜圖Fig. 2 MS full-scan mass spectra of the standard

2.2 對照品貯備液制備

內(nèi)標(biāo)鹽酸苯海拉明貯備液：精密稱取鹽酸苯海拉明20 mg，置于100 mL容量瓶，加入甲醇-水-甲酸溶液溶解并定容至刻度，制備得200 μg/mL的鹽酸苯海拉明貯備液。

2.3 血漿樣品的處理

2.4 專屬性考察

取比格犬空白血漿按2.3項(xiàng)下操作，不加內(nèi)標(biāo)，樣品溶液直接進(jìn)樣獲得空白樣品色譜圖(圖3)。新鮮空白血漿中加入一定濃度的鹽酸坦洛新對照溶液與鹽酸苯海拉明溶液，依照2.3項(xiàng)下操作后進(jìn)樣，獲得相應(yīng)的色譜圖(圖4)。取給藥后的血漿樣品，依同法操作，獲得血漿樣品色譜圖(圖5)。結(jié)果表明，鹽酸坦洛新、鹽酸苯海拉明的保留時(shí)間穩(wěn)定，色譜峰分離度較好，測定分析不受空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

圖3 空白血漿MRM模式色譜圖Fig. 3 MRM chromatogram of blank plasma

圖4 鹽酸坦洛新和鹽酸苯海拉明與空白血漿MRM模式色譜圖

圖5 血漿中鹽酸坦洛新與鹽酸苯海拉明MRM模式色譜圖Fig. 5 MRM chromatograms of tamsulosin hydrochloride or diphenhydramine hydrochloride in plasma

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

精密移取200 μg/mL鹽酸坦洛新貯備液適量，用甲醇-水-甲酸溶液逐級稀釋，制得濃度分別為10、20、50、100、200、500和1000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取200 μg/mL鹽酸苯海拉明貯備液適量，同樣用甲醇-水-甲酸溶液稀釋制得終濃度為400 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液。精密移取500 μL 比格犬空白血漿于肝素化具塞試管，分別加入5 μL鹽酸坦洛新系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，血漿中鹽酸坦洛新的終濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL，按2.3項(xiàng)下操作處理系列樣品，每個(gè)樣品點(diǎn)平行測定3次。以鹽酸坦洛新與內(nèi)標(biāo)物鹽酸苯海拉明的峰面積比對鹽酸坦洛新血漿濃度(C)作圖，以最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算。結(jié)果表明，鹽酸坦洛新的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.116 6X+0.015 3，r=1，鹽酸坦洛新在0.1～10.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)具有可定量計(jì)算依據(jù)的線性相關(guān)性，結(jié)果見圖6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 6 Standard curve

2.6 精密度

精密移取500 μL 比格犬空白血漿于肝素化具塞試管，平行制備6份鹽酸坦洛新終濃度相同的樣品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖與鹽酸坦洛新、內(nèi)標(biāo)物鹽酸苯海拉明峰面積。結(jié)果表明，6份平行樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.1% ,小于 15%，符合生物樣品定量測定分析要求，即鹽酸坦洛新含量測定方法精密度良好。結(jié)果見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 提取回收率

精密移取500 μL 比格犬空白血漿于肝素化具塞試管，加入鹽酸坦洛新平行制備6份終濃度為1.0 ng/mL的樣品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖與鹽酸坦洛新、內(nèi)標(biāo)物鹽酸苯海拉明峰面積。結(jié)果表明，6份平行樣品的平均提取回收率為92%,大于 60%，符合生物樣品定量測定分析要求，即鹽酸坦洛新含量測定方法提取回收率良好。結(jié)果見表3。

表3 提取回收率

2.8 鹽酸坦洛新緩釋片體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.8.1 給藥方案與血樣采集

健康成年雄性比格犬(6只)實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，前肢小隱靜脈處分別固定留置針(規(guī)格為直型18G)，用于空白血漿與含藥血漿的取血。分別灌服鹽酸坦洛新緩釋片2片(相當(dāng)于鹽酸坦洛新400 μg)，于給藥后第0.5、1 、2 、3 、4 、6 、8、10、12、24 h 取前肢靜脈血4 mL，血樣置肝素化試管，4000 r/min離心10 min，分離上清液得血漿樣品，于-20 °C保存待測。

2.8.2 血漿濃度曲線

2.8.1項(xiàng)下各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品按照2.3項(xiàng)下方法處理，計(jì)算得鹽酸坦洛新各時(shí)間點(diǎn)血漿濃度數(shù)值，繪制血漿濃度-時(shí)間曲線。結(jié)果表明基于LC-MS-MS法建立的含量分析方法可有效描述鹽酸坦洛新緩釋片的體內(nèi)含量變化，可作為穩(wěn)定準(zhǔn)確的鹽酸坦洛新含量變化評價(jià)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或臨床研究應(yīng)用。結(jié)果見表4和圖7。

表4 鹽酸坦洛新各時(shí)間點(diǎn)血漿濃度

圖7 鹽酸坦洛新血漿濃度-時(shí)間曲線Fig.7 Blood concentration-time curve of tamsulosin hydrochloride

3 討論

(1)鹽酸坦洛新臨床給藥劑量較小，且緩釋制劑前期藥物釋放量低，常規(guī)手段含量檢測能力有限，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法既可利用液相色譜的復(fù)雜成分分離功能，又可利用質(zhì)譜高靈敏的分辨能力，為鹽酸坦洛新制劑的體外、體內(nèi)含量檢測提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

(2)流動相的選擇對于復(fù)雜成分的分離度及酸、堿性化合物的峰型影響較大。單純的甲醇-水流動相系統(tǒng)，鹽酸坦洛新的出峰時(shí)間較晚，且峰型拖尾嚴(yán)重。由于鹽酸坦洛新含活性較強(qiáng)的伯氨基，具有一定的堿性，在水相中加入1%甲酸可使鹽酸坦洛新分子成鹽增加極性，縮短保留時(shí)間，明顯改善峰型。

(3)鹽酸坦洛新和內(nèi)標(biāo)鹽酸苯海拉明均屬于低極性分子，考慮低極性有機(jī)溶劑作為血漿樣品萃取溶媒。乙醚揮發(fā)性極強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差；乙酸乙酯復(fù)溶后形成混懸體系，須經(jīng)高速離心操作吸取上清液，操作繁瑣；體積比1∶1的正己烷-二氯甲烷溶液作為萃取溶媒易發(fā)生乳化現(xiàn)象，操作難度較大；體積比為2∶1的正己烷-二氯甲烷溶液作為萃取溶媒可簡便充分地將鹽酸坦洛新和內(nèi)標(biāo)鹽酸苯海拉明從血漿樣品中分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

(4) 內(nèi)源性物質(zhì)在色譜分析中與目標(biāo)化合物分離不完全造成的基質(zhì)效應(yīng)會很大程度影響化合物的定量評價(jià)效果，因此嚴(yán)謹(jǐn)評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)是藥動學(xué)研究中不可或缺的評價(jià)內(nèi)容?；|(zhì)效應(yīng)的影響能力與物種差異、性別差異、年齡差異及樣品前處理方法及檢測方法密切相關(guān)。比格犬與人在物種上同為雜食性哺乳動物，血漿中血細(xì)胞、蛋白質(zhì)、酶差異雖較小，但在比格犬的血漿前處理方法推廣的人血漿處理時(shí)，仍應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕|(zhì)效應(yīng)評價(jià)以驗(yàn)證方法的可行性。

4 結(jié)論

本文建立了鹽酸坦洛新緩釋片體內(nèi)含量檢測的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，該方法可快速準(zhǔn)確描述該緩釋片的體內(nèi)含量變化，可作為穩(wěn)定準(zhǔn)確的鹽酸坦洛新含量變化評價(jià)方法進(jìn)行制劑優(yōu)化研究及臨床研究應(yīng)用。