高效液相色譜法測定大蒜素片中DADS和DATS的含量

李天昊 李若琦 黃雪婷 陳梅蘭*

(1．浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015；2. 江蘇常州大學(xué)，常州 213164)

在我國，大蒜素是一類運(yùn)用廣泛的抗菌藥，有抗氧化的作用，能調(diào)節(jié)人的心腦系統(tǒng)的功能，并且在降低血壓血脂以及抗癌方面也有一定的效果。大蒜素是大蒜中具有高度生物活性的主要成分的總稱，學(xué)名為二烯丙基硫代亞磺酸酯，化學(xué)式為C6H10OS2，是否下標(biāo)常見于蔥屬植物中，在新鮮大蒜以及洋蔥等植物里存在。純品大蒜素是無色的油狀物，有大蒜的特殊氣味，微溶于水，易溶于乙醇、苯、乙醚、正己烷等有機(jī)溶劑中[1]，在熱、堿中不穩(wěn)定，在酸中較為穩(wěn)定[2]。

但是新鮮大蒜產(chǎn)生的大蒜素極不穩(wěn)定, 可迅速降解為揮發(fā)性的二烯丙基硫化物(Diallyl sulfide, DAS) 、二烯丙基二硫醚(Diallyl disulfide, DADS) 和二烯丙基三硫醚(Diallyl trisulfide, DATS) 等多種有機(jī)硫化合物[3]，其中DADS和DATS是與大蒜活性的主要成分[4]。DADS是一種有機(jī)硫化合物，有強(qiáng)烈的蒜臭味，也是大蒜油的揮發(fā)性成分，具有較好的抗癌作用[5]。DATS是由大蒜粉碎產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)硫化物化合物,具有其特殊的氣味,不溶于水和乙醇，可與乙醚混溶。DADS和DATS具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等藥用效果[6-8],因此常被制成藥片作為藥用治療，由于DADS和DATS是大蒜素中起作用的活性物質(zhì)，因此藥片中DADS和DATS的含量有極其重要的意義。

目前關(guān)于大蒜中DADS、DATS等系列硫醚化合物測定的方法有很多, 主要有：紫外衍生化法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9，10]、定硫法[11]、高效液相色譜法[12]、薄層掃描法[13]等方法，但大都是對大蒜中單一成分的測定[14]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要較高的溫度，而大蒜素在較高溫度下可能會分解，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差；雖然定硫法方法簡便、快捷、試劑消耗量少【15】，但是其氧化劑用量、酸度、沉淀劑的用量都會對這次實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果有影響。我們采用高效液相色譜法(HPLC)對大蒜素片中的DADS和DATS進(jìn)行測定實(shí)驗(yàn)，該方法操作方便簡單，精確度高。

1 儀器與材料

儀器：Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀(包含二元泵、紫外/可見檢測器等，美國賽默飛世爾科技公司)；恒溫磁力攪拌水浴鍋；超聲波清洗機(jī)；布氏漏斗。

材料：超濃縮大蒜片(200mg/片，杭州綠寶食生物科技有限公司)；DADS(濃度為85%，macklin試劑)；DATS(濃度為65%，macklin試劑)；超純水(≥18.2M·cm，美國Millipore有限公司)；甲醇作為色譜純，甲酸作為分析純。

1.1 樣品的前處理

取超濃縮大蒜素片，將其研磨成粉，精確稱量8.0 g后倒入500 mL錐形瓶中，加入160 mL超純水，溶解搖勻，加入3至8滴濃度為50%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至7。將混勻的上述液體放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中，設(shè)置溫度為60℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，60 min 后，冷卻至室溫，再加入乙醇320 mL，充分搖勻。調(diào)節(jié)水浴鍋溫度到65℃，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為120r/min，加熱60 min，過程中，每隔5 min給錐形瓶開塞放氣。取出后，冷卻到室溫，使用布氏漏斗抽濾。取480 mL濾液放入1000 mL分液漏斗中，加入160 mL正己烷，緩慢振蕩混勻2 min后萃取。靜置后分層，若分層不明顯或者乳化層過厚，則滴入甲醇1～5 mL。待分層徹底后，取上層清液測定。重復(fù)以上操作獲得2份平衡樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取為濃度為85%的DADS和65%DATS適量，用正已烷配制1000 mg/L的DADS和DATS樣品。使用時(shí)用正己烷分別配制成1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。DATS分別配制1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4℃以下冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜條件

使用HypersiL ODS C18柱(4.6x250mm，5μm)為分離柱；以為甲醇、水和甲酸的混合溶液，比例為(85:15:0.1)為流動(dòng)相。流速為1.0 mL/min；檢測波長為225 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：25 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

為了確定DATS以及DADS的最大吸收峰，進(jìn)行全波長掃描，波長在210nm和225 nm時(shí)有最大吸收峰，但考慮甲醇作流動(dòng)相時(shí)，210nm波長甲醇的峰干擾很明顯，因此選擇225nm波長。

2.2 樣品溶劑的選擇

為了選擇更好的樣品溶劑，將研磨好的樣品分別用淋洗液(甲醇-水-甲酸，85∶15∶0.1)、甲醇和正已烷按1.1方法進(jìn)行處理，再色譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有正已烷作溶劑時(shí)，DADS與DATS才出現(xiàn)色譜峰，淋洗液和甲醇作溶劑并不出峰。結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)最后選用正已烷作為溶劑。

結(jié)果表明，DADS和DATS在甲醇和淋洗液定容的標(biāo)準(zhǔn)溶液中不存在出峰，在正己烷中有出峰。這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)物質(zhì)不能溶于淋洗液和甲醇中，但卻能溶解在正己烷中。故只在正己烷中檢測到它們的出峰。

2.3 方法學(xué)考察

按1.3的色譜條件，分別進(jìn)DADS和DATS系列樣品溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，另取濃度為4.0 mg/LDADS和DATS分別進(jìn)樣7次，計(jì)算方法的精密度。結(jié)果見表1。從表1可看出，方法可靠。

表1 線性方程、檢測限及相關(guān)系數(shù)

圖1 正己烷、淋洗液與甲醇作溶劑的色譜圖

2.4 樣品的測定及加標(biāo)回收率

取按1.1 前處理方法處理好的樣品溶液進(jìn)行色譜分析，典型的色譜圖見圖2。

圖2 DADS和DATS的色譜圖

對樣品進(jìn)行加標(biāo)處理后，加標(biāo)回收率見表2。

表2 DADS和DATS的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論與討論

使用HypersiL ODS C18柱(4.6x250mm，5μm)為分離柱；以為甲醇、水和甲酸的混合溶液，比例為(85∶15∶0.1)為流動(dòng)相，波長為225nm時(shí)，DADS和DATS獲得較好的分離，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)表明方法準(zhǔn)確可靠，精密度較好，可應(yīng)用于超濃縮大蒜素片中的DADS以及DATS的測定。