免疫性血小板減少癥患者腸道菌群宏基因組學研究進展

吳 敏， 劉 伶

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是兒童時期臨床最常見的獲得性出血性疾病，主要為體液免疫和細胞免疫異常導致的血小板破壞增多和生成減少。ITP的發(fā)病機制比較復雜，至今仍未完全被了解。傳統(tǒng)觀念認為，抗體包被的血小板通過與Fc γ受體的相互作用在脾臟、肝臟或兩者中過早地被破壞[1]。自身抗體也可以誘導補體介導或去甲?；T導血小板的破壞[2,3]，以及抑制巨核細胞的功能[4]。T細胞的異常愈發(fā)受到重視，包括輔助性T細胞(Th)向1型輔助性T(Th1)和17型輔助性T(Th17)表型傾斜[5]，調節(jié)性T細胞的數(shù)量和功能減少[2,6]，可驅動自身免疫過程。有研究[7]表明CD8細胞也參與其中。因此，免疫異常是其發(fā)病的主要原因，全程表現(xiàn)為異常的抗原表達介導的抗體反應、免疫提呈細胞刺激T淋巴細胞、活化的T淋巴細胞激活B淋巴細胞以及補體、單核-巨噬細胞激活、免疫活性細胞凋亡下調等，其中T細胞免疫異常是關鍵。腸道菌群在免疫調節(jié)自穩(wěn)和免疫耐受中的作用已逐漸明確，并且其失衡在諸多免疫性疾病中起著關鍵的作用。近年部分研究也發(fā)現(xiàn)腸道菌群的失衡可能與ITP的發(fā)病也有一定相關性，可以通過恢復腸道菌群平衡作為防治ITP的一種新的策略。該文就ITP患者腸道菌群宏基因組學研究進展進行綜述。

1 腸道菌群與免疫性疾病的相關性

腸道菌群的菌體抗原及其代謝產(chǎn)物具有促炎和抗炎雙重作用。在小鼠模型中，分段絲狀菌(segmented filamentous bacteria,SFB)可上調回腸內急性期血清淀粉樣蛋白，促進白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-22的產(chǎn)生，誘導Th17分化，從而促進炎癥的發(fā)生[8]；此外有研究[9,10]表明脆弱擬桿菌的多糖A和腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)可導致Treg細胞產(chǎn)生，從而調節(jié)炎癥反應。因此，腸道菌群失調可能會導致腸道屏障與免疫功能減弱，從而增加免疫性疾病的易感性。在無菌條件下，小鼠模型自身免疫性炎癥嚴重程度明顯減弱，且小腸固有層的Th17細胞數(shù)量減少。而將SFB引入無菌小鼠后，固有層的Th17細胞可恢復至正常水平，并迅速出現(xiàn)炎癥反應樣表現(xiàn)[11]，提示SFB可通過促進Th17細胞亞群分化，驅動自身免疫性炎癥的發(fā)生。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)某些人類共生的細菌如梭狀芽孢桿菌Ⅳ、XⅣa和XⅧ，通過產(chǎn)生SCFAs來抑制組蛋白去乙酰酶抑制劑，從而抑制Tregs的增殖，導致Th17/Treg平衡破壞，最終促進炎癥發(fā)生。此外腸道菌群失調可出現(xiàn)腸道黏膜屏障的破壞，腸道通透性增加，導致細菌移位及Th17/Treg平衡破壞，導致炎癥發(fā)生。綜上，免疫性疾病患兒腸道菌群的改變可能有著相似的致病原因。腸道微生物相關分子模式(microbiota-associated molecular patterns,MAMPs)是一類由腸道微生物表達的、反映微生物進化水平的分子，包括脂多糖、多糖A、磷壁酸和肽多糖。MAMPs可被樹突狀細胞、M細胞和腸上皮細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別。PRRs包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)、甲?；氖荏w(formylpeptide receptors,FPRs)和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide binding oligomerization domain like receptors,NLRs)。PRRs作為感受器，跟識別的分子不同，產(chǎn)生不同的效應，包括保護性反應、炎癥反應或觸發(fā)凋亡，因此PRRs在啟動固有免疫和適應性免疫、維持腸道內環(huán)境穩(wěn)定、維持黏膜免疫耐受的完整性方面具有重要的作用。腸道大部分微生物具有相同的MAMPs分子，這些分子在人類長期的進化過程中被宿主先天性免疫識別為無害，當做“老朋友”對待，被PRRs識別以后不引起強烈的免疫反應，而僅產(chǎn)生基礎信號，使宿主對腸道菌群處于耐受狀態(tài)或者維持低水平的“生理性炎癥”。一方面維持機體免疫系統(tǒng)處于適度的“激活或警覺”狀態(tài)，如增加樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)表面共刺激分子(CD80、CD83、CD86等)的表達，促進DCs成熟和分泌細胞因子；另一方面調節(jié)或抑制機體過度的炎癥反應，如誘導產(chǎn)生調節(jié)性T細胞和調節(jié)細胞因子如IL-10和轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等，從而產(chǎn)生對機體的保護性免疫反應。顯然腸道菌群在維持腸道黏膜免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。動物模型提示，腸道共生菌和由他們產(chǎn)生的各種配體在腸道黏膜保護和修復中起到?jīng)Q定性作用，共生菌分泌的脂多糖、脂磷壁酸等，以及代謝產(chǎn)生的丁酸作為TLR的配體，與正常腸道表面的TLR相互作用，產(chǎn)生基礎信號。這些信號使得腸上皮細胞耐受損傷的能力增強，獲得腸道表面的動態(tài)平衡，同時也使腸道表面具有更強的修復能力，保持腸道的健康和微生態(tài)的平衡。TLRs作為一組跨膜的PRRs，其在血小板與自身抗體的協(xié)同作用在ITP發(fā)病機制中的作用受到關注。TLRs通過抗原相關分子模式(pathogen-associated molecule pattern，PAMP)識別細菌和病毒的脂多糖或核酸，激活不同通路傳遞細胞內信號，致使B淋巴細胞產(chǎn)生如IL、干擾素(interferon,IFN)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎性細胞因子，激活免疫系統(tǒng)活化抗原呈遞細胞，從而產(chǎn)生保護性免疫反應。有益的共生微生物能減少機會性感染的發(fā)生，其還能直接或間接地抵御病原菌的定植及增強腸道免疫屏障功能，從而阻止免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。

2 腸道菌群與ITP的相關性

TLRs是腸道免疫系統(tǒng)介導識別和殺滅細菌的重要組成部分，同時具有保持對腸道共生菌的耐受性、維持腸道穩(wěn)態(tài)的作用。有研究[13]發(fā)現(xiàn)TLRs的表達與擬桿菌、腸桿菌及腸球菌的含量呈正相關，與雙歧桿菌和乳桿菌的含量呈負相關。一項對9例ITP患者與10名健康成人的糞便樣本進行16S rDNA高通量測序研究[14]也提示ITP患者腸道菌群存在擬桿菌增多，厚壁菌減少的情況。這些研究都提示TLRs的高表達可能與ITP的發(fā)生密切相關，免疫性疾病患者腸道菌群失調能夠增強腸黏膜中TLRs的表達，介導過度的免疫反應。血小板上表達的TLRs，主要是TLR 4、TLR 7和B淋巴細胞活化因子(B lymphocyte activaion factor,BAFF)。血小板表面TLRs的存在提示這些細胞存在于循環(huán)中。感染發(fā)生后由于TLRs參與識別感染性抗原從而加速了受體-Fc介導的吞噬作用，導致抗血小板抗體產(chǎn)生和血小板破壞增加[15]。由感染因素觸發(fā)，TLRs協(xié)同發(fā)生的血小板破壞可以解釋為何一些ITP患者經(jīng)過抗感染治療后血小板減少可以獲得自限和緩解，而部分患者感染觸發(fā)因素消失后，免疫紊亂還不能糾正，導致疾病慢性化趨勢。研究[16]發(fā)現(xiàn)，ITP患者的脾臟B淋巴細胞和循環(huán)B淋巴細胞的TLRs及下游細胞因子(包括IL-10和IL-1β)均有上調，說明B淋巴細胞的TLRs在ITP的發(fā)病機制中可能有雙重作用。有研究表明，Th1/Th2的失衡與ITP的發(fā)生有關。Kuwana等[17]在慢性ITP患者中發(fā)現(xiàn)GPⅡb/Ⅲa的自體反應性T淋巴細胞。其他研究也支持慢性ITP患者Th1/Th2失衡極化，往往Th1細胞明顯上升。Th1細胞釋放的細胞因子IL-2、IFN-α、TNF-β參與了Th1、Th2、細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)及巨噬細胞的趨化和血小板破壞。而免疫異常狀態(tài)的單核細胞也釋放TNF，促進了Th1的增加。Th2向Th1轉變依賴于多種因素，但細菌刺激有相當?shù)淖饔?。近期有研究[18]證實口腔中的克雷伯桿菌發(fā)生異位定植于腸道時，可侵入腸上皮細胞被DCs細胞吞噬，釋放IL-6和TNF，促進Th1細胞的炎癥反應。此外無菌小鼠的研究證明，腸道正常菌群中屬于擬桿菌門的脆弱類桿菌，不僅能夠促進脾臟和胸腺的這些外周淋巴組織的細胞和生理的成熟，還能夠糾正全身淋巴細胞缺乏，增強分泌IFN-γ的Th1反應。進一步研究證實這個過程是由脆弱類桿菌外膜上的多糖A(polysaccharide A，PSA)完成的，缺乏PSA的類桿菌，則不能誘導T細胞的分化，而純化的PSA則有和野生脆弱類桿菌相同的作用。PSA被DCs攝取、加工后，與MHCⅡ類分子一起形成MHC-抗原復合物被T細胞表面的抗原特異性受體(T cell receptor,TCR)識別，激活T細胞免疫應答。PSA刺激DCs的TLR2產(chǎn)生IL-12，IL-12與T細胞IL-12受體結合，活化Th1轉錄子Stat-4，進一步生成IFN-γ。有研究[19]還發(fā)現(xiàn)脆弱類桿菌PSA能夠誘導腸黏膜固有層以及血液循環(huán)CD4+T細胞分化為可分泌IL-10的Treg細胞發(fā)揮抑制促炎Th17反應的作用，在精細調節(jié)Th17和Treg細胞平衡中具有重要作用。研究表明，慢性ITP患者Th17細胞及其分泌的細胞因子IL-17較對照組明顯升高[5]，而成人及兒童ITP患者中均檢測到二者升高[20]，提示Th17細胞與ITP患者發(fā)病可能相關。研究[21]發(fā)現(xiàn)，ITP患者Treg下降，獲得治療后得以回升。其他研究[22]也發(fā)現(xiàn)ITP患者Th1、Th17上升和Treg下降。研究[23，24]發(fā)現(xiàn)Treg/Th17的比值與ITP的病程多樣性及預后相關。此外，有研究[25]表明大劑量地塞米松聯(lián)合利妥昔單抗治療ITP可有效提高Treg水平，長期療效顯著優(yōu)于潑尼松和單純地塞米松組。因此與Th1、Th17和Treg平衡相關的脆弱類桿菌在ITP發(fā)病中的作用值得進一步研究，特別是其是否在慢性、難治性ITP患者中起到作用，有利于提示一種新的了解預后以及進行干預的思路。此外SFB是另一種受到越來越多關注的腸道共生菌。研究[26]表明SFB能夠介導小腸中Th17細胞的發(fā)育和誘導潘氏結中Th1和Treg細胞水平上升，從而對腸道黏膜免疫發(fā)揮廣泛的調節(jié)作用。也有研究[27]證實,口服假絲酵母菌可以減少自身免疫性疾病患者體內Th17細胞數(shù)量，抑制腸道IL-6的產(chǎn)生，并增加調節(jié)性T細胞數(shù)量，提示膳食酵母可能是通過改變腸道菌群組成對自身免疫性疾病產(chǎn)生有利影響。Smith等[28]發(fā)現(xiàn)，腸道微生物所釋放的SCFAs能調節(jié)RORγt活性，從而調控非致病性與致病性Th17細胞間的平衡。不同的腸道微生物可以刺激Th17細胞產(chǎn)生不同的細胞因子，并發(fā)揮相應的功能。

3 宏基因組學在ITP中的應用及展望

腸道菌群可通過其代謝產(chǎn)物及其他特異性的成分激活免疫細胞，如Th17細胞和Treg細胞，誘導其分化方向及分泌功能。而研究[29]證明ITP患者還存在B淋巴細胞的質和量的異常。有研究[30，31]表明自身免疫性疾病患者中Breg細胞受損或數(shù)量減少，而從小鼠模型了解到Breg可促進Treg細胞的分化及趨化。因此ITP患者Breg細胞的受損可能導致Treg細胞不能正常的分化，以致抗體介導的T淋巴細胞參與的血小板破壞增多。宏基因組學研究對特定環(huán)境中全部微生物的總DNA進行克隆，并通過構建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質；或者根據(jù)rDNA數(shù)據(jù)庫設計引物，通過系統(tǒng)學分析獲得該環(huán)境中微生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)信息?？山忉屛⑸锶郝涠鄻有浴⑦M化關系、種群結構、功能活性及環(huán)境之間的相關關系，極大擴展了微生物的研究范圍。目前宏基因組學在ITP中的研究常為通過16S rDNA研究ITP患者的腸道菌群多樣性，找到其潛在致病菌，但目前各研究的樣本量均較少，且缺乏多中心的研究。以后可進行多中心的研究，以確定可能潛在的致病菌，后續(xù)通過對相關菌群總DNA進行克隆，明確其具體的分子機制，以便于靶向治療，及早干預。