MicroRNA對(duì)阿霉素引起心臟毒性的診斷及機(jī)制研究進(jìn)展

蘇毅馨，朱世杰，薛 鵬，毛 昀，李林潞

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102)

阿霉素(doxorubicin，Dox)是一種高效的蒽環(huán)類化療藥物，可用于治療一些兒童和成人腫瘤，但具有劑量依賴性心臟毒性，可引起亞臨床心室功能障礙，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌病和心力衰竭[1]。盡管經(jīng)歷數(shù)十年研究，在分子及病理生理學(xué)方面取得了重大進(jìn)展，但仍存在缺乏敏感的預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物、治療藥物及機(jī)制未完全闡述等問(wèn)題。因此迫切需要早期診斷及探索新的治療靶點(diǎn)來(lái)防治Dox誘導(dǎo)的心臟毒性。

microRNA (miRNA)是一類內(nèi)源性的保守的小分子(22-24核苷酸)非編碼RNA，可抑制和/或降解目標(biāo)信使RNA，影響基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)而調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和死亡等，若miRNA功能失調(diào)，可引起腫瘤或者心臟病[2]。由于miRNA在幾乎所有體液(血液、血清、血漿、尿液和唾液)中穩(wěn)定表達(dá)，具有組織特異性，且其檢測(cè)的精確定量技術(shù)發(fā)展[3]，已成為多種疾病的可能特異性生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)研究對(duì)象[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA不僅參與調(diào)節(jié)心臟電信號(hào)傳導(dǎo)、心肌收縮，也可作為心血管疾病的非侵入性和特異性的循環(huán)標(biāo)志物[5-7]，目前亦有研究在阿霉素引起的心臟毒性方面進(jìn)行臨床相關(guān)性及機(jī)制探討[8,9]，因此該綜述將針對(duì)miRNA在阿霉素心臟毒性的生物標(biāo)記物、機(jī)制方面的研究進(jìn)展具體論述。

1 生物標(biāo)記物

目前指南[10]推薦肌鈣蛋白(cTn)、腦利鈉肽(BNP)作為血液循環(huán)生物標(biāo)志物用于監(jiān)測(cè)蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的心臟毒性，cTn雖是心臟損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，但僅在心臟壞死時(shí)釋放[11]，考慮到目前生物標(biāo)志物的局限性，因此迫切需要識(shí)別新的穩(wěn)定、高靈敏度生物標(biāo)志物以鑒定心臟損傷早期事件及限制損傷程度。下面為更清楚闡述關(guān)于miRNA在Dox心臟毒性中作為生物標(biāo)記物的研究，將通過(guò)研究者單個(gè)miRNA研究及成組miRNA研究進(jìn)行闡述。

1.1 單個(gè)miRNA研究

2012年Fu等[12]首次報(bào)道Dox誘導(dǎo)的心臟損傷模型中l(wèi)et-7g的血漿濃度與心臟功能指標(biāo)cTnT等具有相關(guān)性。在Dox劑量為18 mg/kg的實(shí)驗(yàn)組中表現(xiàn)出明顯let-7g下調(diào)并伴有心率下降，但作者的討論主要集中在可能靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)方面，并未通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證推測(cè)[11]；2015年Oliveira Carvalho等[13]對(duì)59名乳腺癌含阿霉素化療方案患者化療周期前后檢測(cè)miR-208a表達(dá)，將血清cTnI血清水平高于40 pg/mL，LVEF相對(duì)于基線值明顯下降為心功能異常參考值。研究結(jié)果表明7名患者 (11.86%)出現(xiàn)心臟毒性癥狀，cTnI升高，LVEF降低，但令人失望的是在該7名患者中均未檢測(cè)到miR-208a表達(dá)，因此miR-208a不能作為Dox誘導(dǎo)心臟毒性的乳腺癌患者有用的生物標(biāo)志物；2017年，Rigaud等[14]利用CECCY試驗(yàn)的一個(gè)分支(ClinicalTrials.govNCT01724450)研究miRNA作為可能的心臟毒性循環(huán)標(biāo)志物的適用性。研究對(duì)象為56名女性乳腺癌含阿霉素化療方案患者，每化療周期后3周檢測(cè)血漿cTnI、miR-1、miR-133b、miR-146a、miR-208a、miR-208b、miR-423-5p水平。上訴選取研究的miRNA中除miR-146a外，余均在文獻(xiàn)中記載為心臟疾病(心肌損傷、心力衰竭、藥物誘導(dǎo)心臟毒性)的循環(huán)標(biāo)志物[15,16]，將化療期間或化療后LVEF較基線降低≥10%和/或LVEF值<50%為心臟毒性標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果表明從基線到Dox治療結(jié)束的每個(gè)周期后，cTnI的平均血漿水平均升高但變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miRNA表達(dá)分析表明所有受試者的miR-1均隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，其表達(dá)水平與LVEF變化相關(guān)，與非心臟毒性患者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-208a和miR-208b未檢測(cè)到，miR-133b、-146a和-423-5p雖可檢測(cè)到，但未顯示與心臟毒性發(fā)作相關(guān)的表達(dá)變化，均不能成為有效的循環(huán)標(biāo)志物，因此循環(huán)miR-1可作為阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌患者心臟毒性的潛在生物標(biāo)志物；Ruggeri等[9]研究表明在急性蒽環(huán)類藥物給藥后，miR-34a-5p在表達(dá)水平升高，有趣的是，除Dox誘導(dǎo)的心臟毒性[17]外，miR-34a-5p升高提示與心肌梗死后心室重構(gòu)和心衰發(fā)作相關(guān)[18,19]，抑制其表達(dá)對(duì)心臟功能障礙有益[20]，提示其可能作為一種生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)進(jìn)行臨床開(kāi)發(fā)。

1.2 成組miRNAs研究

2014年，Desai等[21]對(duì)1 179個(gè)miRNAs進(jìn)行了表達(dá)譜分析。研究者將雄性B6C3F1小鼠實(shí)驗(yàn)組予3 mg/kg Dox靜脈注射，累積劑量分別為6～24 mg/kg，研究結(jié)果表明予18 mg/kg和更高累積劑量的Dox的小鼠出現(xiàn)心臟損傷，共24個(gè)miRNAs在小鼠心臟中有差異表達(dá)，其中促凋亡的miR-34a是所有累積劑量下唯一上調(diào)的miRNA，并呈劑量相關(guān)性。當(dāng)Dox累積劑量6 mg/kg時(shí)，miR-34a上調(diào)可能提示凋亡是經(jīng)Dox處理的小鼠心臟的早期分子變化。累積劑量12 mg/kg時(shí)，miR-34a上調(diào)與心肌細(xì)胞肥大miR-150下調(diào)相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)提示miR-34a可能作為在心肌肌鈣蛋白釋放之前的早期生物標(biāo)志物；Leger等[22]對(duì)33名癌癥兒童在接受蒽環(huán)類化療方案 (n=24)或非蒽環(huán)化療(n=9)前后進(jìn)行了24種miRNA的血漿分析，在兩組治療前后(6、12、24 h)的測(cè)定miRNA變化，并進(jìn)行組間比較。研究結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組在用藥6～24 h后血漿miR-29b和miR-499上調(diào)，其化療后表達(dá)與劑量顯著相關(guān)，且表達(dá)高于對(duì)照組。該研究提示對(duì)miRNAs的進(jìn)一步評(píng)估可能為阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的生物標(biāo)志物；Ruggeri等[23]選用20只C57BL/6雌性小鼠為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組在2周內(nèi)予24 mg/kg劑量DOX，研究周期6周，實(shí)驗(yàn)前后予心功能監(jiān)測(cè)及miRNA水平檢測(cè)，研究結(jié)果為實(shí)驗(yàn)組中有5只小鼠與對(duì)照組相比心功能無(wú)顯著性差異，對(duì)發(fā)生心臟毒性組小鼠血漿予miRNA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為miR-1-3p、miR-122-5p、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-215-5p、miR-455-3-p和miR-499a-5p 7種miRNA下調(diào)，而miR-34a-5p在Dox處理組血漿樣本中水平升高，該研究表明予Dox后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可對(duì)治療表現(xiàn)出不同的心臟反應(yīng)，并且存在特異性的miRNA，其表達(dá)可反映藥物誘導(dǎo)損傷后心臟功能障礙的存在。

2 機(jī)制研究

阿霉素心臟毒性有別于靶向治療以及免疫治療引起的心臟毒性，其引起的心肌損傷呈劑量相關(guān)性，伴有心肌細(xì)胞死亡，但其心臟毒性機(jī)制至今仍未完全明確，目前廣泛研究的機(jī)制包括氧化應(yīng)激損傷機(jī)制、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ機(jī)制、線粒體功能受損等。miRNA在其機(jī)制方面研究也主要集中在細(xì)胞凋亡、影響相關(guān)信號(hào)通路方面，闡述如下：

2.1 細(xì)胞凋亡

張曉潔等[24]研究發(fā)現(xiàn)Dox處理后心肌細(xì)胞中miRNA-532-3p的表達(dá)明顯升高，可引起ARC下調(diào)，ARC(apoptosis repressor with caspase recruitment domain)是一個(gè)內(nèi)源性抗凋亡蛋白，可同時(shí)抑制內(nèi)源和外源的凋亡途徑，miR-532-3p可以靶向ARC的3' UTR。抑制miR-532-3p可明顯抑制DOX引起的線粒體分裂和凋亡，且miR-532-3p可以直接作用于ARC3'UTR而抑制ARC的表達(dá)。因此MiR-532-3p通過(guò)調(diào)控ARC的表達(dá)參與Dox引起的心肌細(xì)胞線粒體分裂和細(xì)胞凋亡，并且抑制miR-532-3p并不影響Dox引起的腫瘤細(xì)胞凋亡；唐玉婷等[25]研究發(fā)現(xiàn)Dox引起心肌細(xì)胞損傷后可引起miR-126-5p表達(dá)明顯上調(diào)，LDH的釋放增加及caspase-3活性升高，降低心肌細(xì)胞活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮促心肌損傷作用；Jing等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-29b是miR-29家族中唯一在經(jīng)Dox處理的大鼠心肌中顯著下調(diào)的成員。上調(diào)miR-29b表達(dá)可抑制Dox誘導(dǎo)的心肌凋亡，使Bcl-2表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低，caspase-3活性降低。miR-29b通過(guò)直接靶向Bax,通過(guò)抑制線粒體依賴途徑來(lái)阻止Dox誘導(dǎo)的心肌凋亡，這表明miR-29b是治療Dox心臟毒性的一個(gè)潛在的新的治療靶點(diǎn)。

2.2 線粒體損傷

Du等[27]研究發(fā)現(xiàn)Dox濃度升高可顯著增加MiR-23a的表達(dá)。抑制miR-23a可顯著提高心肌細(xì)胞的生存力和減少細(xì)胞死亡和ROS的產(chǎn)生。miR-23a抑制靶標(biāo)PGC-1α表達(dá)及Drp1的磷酸化水平，但不影響Mfn2的表達(dá)，抑制Cyt C和裂解的caspase-3蛋白表達(dá)。因此在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性細(xì)胞模型中，miR-23a可促進(jìn)線粒體損傷。抑制miR-23a作用于 PGC-1α/ p-Drp1而抑制線粒體依賴細(xì)胞凋亡及心肌損傷。

2.3 調(diào)節(jié)靶基因

miR-146a在心臟中表達(dá)豐富，2010年Takahiro等[28]首次發(fā)表研究報(bào)告表明由Dox引起心臟毒性的動(dòng)物模型中miRNA的表達(dá)受干擾。予20 mg/g DOX治療1 d后，雄性C57BL/6小鼠心臟中ErbB2受體酪氨酸激酶4 (ErbB4)表達(dá)明顯降低，ErbB4 3'UTR是miR-146a的一個(gè)可靠靶點(diǎn)。Dox誘導(dǎo)的心肌凋亡可能與miR-146a介導(dǎo)下調(diào)ErbB4相關(guān)，但目前仍缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持miR-146a為誘導(dǎo)Dox心臟毒性的因果機(jī)制；miR-21參與心力衰竭、心肌纖維化、心肌凋亡過(guò)程[29-31]?；谏鲜鲅芯砍晒?，Tong等[32]研究miR-21在Dox介導(dǎo)的急性、慢性心臟毒性中的表達(dá)。研究結(jié)果表明miR-21過(guò)表達(dá)減輕心肌凋亡，其機(jī)制與miR-21的靶基因B細(xì)胞易位基因2 (BTG2)相關(guān)，Dox引起心肌細(xì)胞細(xì)胞中BTG2的表達(dá)明顯降低，miR-21可能通過(guò)BTG2靶向基因保護(hù)心肌細(xì)胞。然而,盡管BTG2被證實(shí)是miR-21的一個(gè)可靠靶點(diǎn)，但其在細(xì)胞凋亡中的作用仍未研究清楚；Hui等[33]研究表明，核苷通過(guò)miR-21的表達(dá)參與調(diào)控阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷和功能障礙，可能是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)；Roca-Alonso等[34]研究發(fā)現(xiàn)miR-30家族在Dox誘導(dǎo)的心力衰竭中下調(diào)，高miR-30水平對(duì)Dox心臟毒性具有保護(hù)作用，可減少活性氧生成。機(jī)制可能為通過(guò)靶點(diǎn)Giα-2調(diào)節(jié)β-腎上腺素能通路，減弱心肌細(xì)胞對(duì)β-腎上腺素受體 (βAR)刺激的收縮反應(yīng)。miR-30家族亦可靶向作用促凋亡基因BNIP3L/NIX調(diào)節(jié)心肌凋亡。此外研究認(rèn)為Dox可誘導(dǎo)GATA-6表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞中miR-30的急性和持續(xù)下調(diào)。miR-30過(guò)表達(dá)可保護(hù)心肌細(xì)胞不受劑量誘導(dǎo)的凋亡，因此維持其表達(dá)可能對(duì)蒽環(huán)類藥物是一種潛在的心臟保護(hù)策略。該項(xiàng)研究首次探討了miR-30家族對(duì)Dox心臟毒性影響，可能為未來(lái)的治療應(yīng)用提示了新的思路，但仍缺乏體內(nèi)研究，需要進(jìn)一步研究證實(shí)其作用機(jī)制；miR-208a是一種調(diào)節(jié)心臟應(yīng)激反應(yīng)的心臟特異性microRNA，在心梗、擴(kuò)張型心肌病等多種心臟疾病中均有上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)[35]，在已證實(shí)的miR-208a的靶點(diǎn)中，GATA4是一種心臟富轉(zhuǎn)錄因子，已知它可調(diào)控包括抗凋亡基因BCL-2在內(nèi)的幾種心臟基因的表達(dá)[36]。GATA4耗竭是阿霉素導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的獨(dú)特機(jī)制，而維持GATA4水平已被證明可減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心功能障礙，Tony等[37]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素明顯上調(diào)miR-208a，下調(diào)GATA4，增加心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心功能下降。而抑制miR-208a表達(dá)可增加GATA4和BCL-2，減少細(xì)胞凋亡，改善心功能；miR-140-5p直接靶向Nrf2和Sirt2，影響HO-1、NQO1、Gst、GCLM、Keap1和FOXO3a的表達(dá)水平[38]，從而增加了Dox引起的心肌損傷。因此，miR-140-5p通過(guò)靶向Nrf2和Sirt2促進(jìn)心肌氧化應(yīng)激，在Dox誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮重要作用。為研究阿霉素引起的心臟損傷提供了新的見(jiàn)解。此外，miR-140-5p/ Nrf2和miR-140-5p/Sirt2可能成為治療劑量誘導(dǎo)的心臟毒性的新靶點(diǎn)；Gupta等[39]發(fā)現(xiàn)在Dox介導(dǎo)的心臟毒性動(dòng)物模型中miR-212/132過(guò)表達(dá)，可抑制左室質(zhì)量增加和左室壁心肌萎縮厚度，減少細(xì)胞凋亡防止肌原纖維損傷。脂肪儲(chǔ)存誘導(dǎo)跨膜蛋白質(zhì)2 (Fitm2)和下游效應(yīng)體分子可能為其作用靶點(diǎn)；Piegari等[40]研究表明在予Dox處理后心肌細(xì)胞中的miR-34a水平升高，且抑制miR-34a有益于心肌祖細(xì)胞增殖、凋亡和衰老。機(jī)制為miR-34a靶向升高Bcl-2和SIRT1，降低p53和p16INK4a乙?；?。抑制miR-34a也可減少對(duì)其他心肌細(xì)胞的負(fù)旁分泌作用影響；Vacchi-Suzzi等[41]研究報(bào)道Dox誘導(dǎo)的慢性心肌毒性與多種miRNAs和心肌疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)有關(guān)。該研究中Dox的累積劑量范圍為2-18 mg/kg。隨劑量增加可特異性地誘導(dǎo)大鼠心臟中miR-208b、miR-216b、miR-215、miR-34c和miR-367的上調(diào)。此外，最低劑量(1 mg/kg/周，持續(xù)2周)可導(dǎo)致miR-216b在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)或經(jīng)典心臟應(yīng)激生物標(biāo)志物改變的情況下顯著升高。miR-34c可在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)由Dox誘導(dǎo)的Sipa1 mRNA(一種絲裂原誘導(dǎo)的Rap/Ran GTPase激活蛋白)的變化。上訴作用靶點(diǎn)的機(jī)制發(fā)現(xiàn)可能為治療Dox介導(dǎo)的心臟毒性提供新的思路。

2.4 信號(hào)通路

Chen等[42]研究發(fā)現(xiàn)miR-320a可通過(guò)增加多種危險(xiǎn)因素和下調(diào)SRF參與動(dòng)脈粥樣硬化形成并且使用蒽環(huán)類聯(lián)合化療的患者循環(huán)miR-320a降低?；谏显V研究成果進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)[43]，研究表明予Dox處理后小鼠心肌miR-320a表達(dá)增強(qiáng)，心肌微血管密度降低，心功能受損。miR-320a過(guò)表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，加重心臟血管異常，進(jìn)而加重小鼠心功能障礙。而miR-320a下調(diào)可促進(jìn)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，減輕阿霉素引起的心功能異常。其機(jī)制為miR-320a通過(guò)潛在靶點(diǎn)VEGF-A抑制影響心臟血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮重要作用，因此，抑制miR-320a可能用于治療蒽環(huán)類藥物引起的心功能障礙；Wan等[44]研究了miR-15b-5p在阿霉素劑量誘導(dǎo)的心臟毒性中的作用。研究發(fā)現(xiàn)在暴露于Dox的H9c2心肌細(xì)胞中，miR-15b-5p表達(dá)上調(diào)，Bmpr1a和Gata4 mRNA表達(dá)下調(diào)。Bmpr1a被認(rèn)為是miR-15b-5p的潛在靶點(diǎn)，miR-15b-5p可能通過(guò)影響B(tài)cl-2/Bax的蛋白表達(dá)比例和Akt的激活加劇Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而這種促凋亡作用可被Bmpr1a激動(dòng)劑抑制，對(duì)Bmpr1a信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用；Li等[45]探討miR-451對(duì)dox誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性的影響。研究表明miR-451在阿霉素處理組心肌細(xì)胞中顯著升高。抑制miR-451表達(dá)可減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并上調(diào)鈣結(jié)合蛋白39 (Cab39)和活化的磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路的表達(dá)。

3 討論

由于miRNA的組織特異性及穩(wěn)定性，檢測(cè)miRNA表達(dá)可以提供有價(jià)值的阿霉素心臟毒性的早期基因組生物標(biāo)志物以及對(duì)潛在分子通路的新機(jī)制的深入了解，為治療提供新的思路，但仍面臨著挑戰(zhàn)及限制。如篩選候選miRNA時(shí)主要根據(jù)既往阿霉素心臟毒性機(jī)制以及研究miRNA數(shù)目較少，這一選擇可能會(huì)限制對(duì)新穎性和潛在的新發(fā)現(xiàn)；其次部分研究對(duì)研究樣本只提到心臟樣本，未標(biāo)明整個(gè)心臟還是部分心臟或心臟特定組織如心房或心室被用于分析，因此很難對(duì)不同的研究進(jìn)行比較；缺乏多中心、大樣本的臨床研究；最后，最重要的問(wèn)題是RT-qPCR評(píng)估m(xù)iRNA表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化策略，可影響研究結(jié)果的重復(fù)性。因此，準(zhǔn)確的和被廣泛接受的研究方案應(yīng)該被執(zhí)行和采用，為獲得具有很強(qiáng)臨床相關(guān)性的結(jié)果鋪平道路。